זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל

תאי גזע גליומה הם תת-אוכלוסייה של תאים בליומה, אשר בדרך כלל עמידים לכימותרפיה והקרנות. כאן תיארנו את השיטה לזיהוי מהיר של טיפולים משולבים, מיקוד תאי גזע גליומה, במקום תאי גליומה מובחנים. בהשוואה לשיטות אחרות, אשר עשוי להיות מייגע ומסובך.

פרוטוקול זה הוא פשוט ומהיר יחסית, כדי לזהות שילובי סמים שימושיים פוטנציאליים. התחל על ידי איסוף תאי גזע גליומה או GSCs ממדיום התרבות, ו centrifuging אותם ב 70 פעמים G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת supernatant, לעכל את התאים עם accutase במשך ארבע דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

בעזרת קצה של 200 מיקרוליטר, מעבירים את התאים שוב ושוב כדי לנתק, ומציבים מחדש את גלולה התא. הוסף את GSCs בצפיפות של 200, 000 תאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות, לתוך כל באר של צלחת תרבות 12 היטב, ודגר אותם בן לילה. למחרת, להוסיף 30 microliters של לוציפראז-eGFP וירוס supernatant לתוך כל באר של הצלחת.

צנטריפוגות התאים ב 1000 פעמים G במשך שעתיים, ב 25 מעלות צלזיוס ולדגירה אותם בן לילה. למחרת, להחליף את המדיום בבארות על ידי איסוף GSCs, centrifuging אותם, הסרת supernatant, שימוש חוזר אותם במדיום טרי, ותליכתם מחדש. תרביתי את התאים לעוד 48 שעות.

שים לב ללוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולאשר את המראה של תאים חיוביים GFP. מיין ואסוף את GSCs עם פלואורסצנטיות גבוהה באמצעות ממיין תאי זרימה ותרבות אותם עוד יותר. מעיל, 96 לוחות תחתית אופטיים היטב עם תערובת מטריצה חוץ תאית, כגון מטריגל, ודגרה אותם במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.

הסר את התערובת עודפת בעדינות לשטוף את הצלחות פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן זרע XG387-לוק תאים בצפיפות של 1000 תאים ב 100 microliters של מדיום תרבות, ולכל באר של לוחות מצופים ותרבות אותם בן לילה. למחרת, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר את ההתקשרות שלהם לצלחת. לאחר מכן להכין פתרון טמוזולומייד 200 מיקרומולר ושני פתרונות מיקרומולרים של הסוכנים הממוקדים, במדיום תרבות.

עבור הקרנת תרופות משולבת, להסיר את המדיום הריק ולהוסיף את המדיום המכיל או 200 טמוזולומייד מיקרומולארי או שני סוכן ממוקד micromolar, או שילוב של שניהם, לתוך כל באר עבור שלושה שכפולים טכניים לטיפול. לדגור את הלוח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. צלם תמונות של הביולומינציה התאית בצלחת באמצעות מערכת ההדמיה בספקטרום IVIS.

באמצעות התוכנה המובנית, ליצור אזורים מעגליים מרובים של אזור העניין ולכומת את הביולומינציה התאית. כדי לזהות מועמדים פוטנציאליים שיכולים לשפר את אפקט האנטיגליובלסטומה של טמוזולומייד, 20 מעכבי מולקולות קטנות סלקטיביות המטרה נותחו באמצעות הקרנת שילוב תרופות. ערכי המדד הרגישים של 13 סוכנים ממוקדים היו מעל לאפס וחמישה מהם היו מעל 0.1.

המדד הרגיש של שתי התרופות המובילות UMI-77 ו- A 83-01, היו גבוהים מ-0.25, מה שמצביע על הפוטנציאל שלהם להתמזמז עם טמוזולומייד. הטיפול המשולב של temozolomide ו UMI-77 הוערך באמצעות תיעוב אנטי-הפצה בשש על שש מנות טיטריון מטריצה. ערכי אינדקס השילוב היו פחות מאחד.

וערכי הסוכן הבודד הגבוהים היו גדולים מאפס עבור רוב השילובים של טמוזולומייד ו- UMI-77 בריכוזים שונים. מציע אינטראקציה סינרגטי הכוללת של טמוזולומייד ו- UMI-77 הן ב- XG387 והן ב- XG328 GSCs. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם במציאת שילוב סמים באמצעות תאים סרטניים דבקים פשוט על ידי הסרת שלב ציפוי הצלחת.