Glioma kök Hücreleri, gliomadaki hücrelerin genellikle kemoterapi ve radyoterapiye dirençli alt popülasyonudur. Burada farklılaştırılmış glioma hücreleri yerine glioma kök hücrelerini hedef alan kombinasyon tedavilerinin hızlı tanımlanması için yöntemi tanımladık. Zahmetli ve karmaşık olabilecek diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında.
Bu protokol, potansiyel yararlı ilaç kombinasyonlarını tanımlamak için nispeten basit ve hızlıdır. Glioma kök hücrelerini veya GSC'leri kültür ortamından toplayarak ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca 70 kez G'de santrifüjleyarak başlayın. Süpernatantı çıkardıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede dört dakika boyunca accutase ile sindirin.
200 mikroliter ucu kullanarak, hücreleri ayrıştırmak için tekrar tekrar pipetlayın ve hücre peletini yeniden biriktirin. GSC'leri bir mililitrelik kültür ortamında 200.000 hücre yoğunluğunda, 12 kuyu kültür plakasının her kuyusuna ekleyin ve bir gecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, plakanın her kuyusuna 30 mikrolitre luciferaz-eGFP virüs süpernatantı ekleyin.
Hücreleri iki saat boyunca 1000 kez G'de, 25 santigrat derecede santrifüj edin ve bir gecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, GSC'leri toplayarak, santrifüj ederek, süpernatantı çıkararak, taze ortamda yeniden oluşturarak ve yeniden sıçratarak kuyulardaki ortamı değiştirin. Hücreleri 48 saat daha kültüre edin.
Plakayı floresan mikroskop altında gözlemleyin ve GFP pozitif hücrelerin görünümünü onaylayın. Akış hücresi sıralayıcısı kullanarak yüksek floresanlı GSC'leri sıralayın ve toplayın ve daha fazla kültüre edin. Kat, matrigel gibi hücre dışı matris karışımına sahip 96 kuyu optik alt plaka ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatır.
Fazla karışımı çıkarın ve plakaları PBS ile bir kez hafifçe durulayın, ardından XG387-Luc hücrelerini 100 mikrolitre kültür ortamında 1000 hücre yoğunluğunda ve kaplanmış plakaların her kuyusuna koyun ve bir gecede kültüre edin. Ertesi gün, plakaya bağlanmalarını onaylamak için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Daha sonra kültür ortamında 200 mikromoler temozolomid çözeltisi ve hedeflenen ajanların iki mikromolar çözeltisini hazırlayın.
Kombinasyon ilaç taraması için, boş ortamı çıkarın ve tedavi başına üç teknik çoğaltma için her kuyuya 200 mikromoler temozolomid veya iki mikromolar hedefli ajan veya her ikisinin bir kombinasyonunu içeren ortamı ekleyin. Plakayı üç gün boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın. IVIS spektrum görüntüleme sistemini kullanarak plakadaki hücresel biyolüminesans görüntülerini alın.
Yerleşik yazılımı kullanarak, ilgi alanının birden fazla dairesel alanını oluşturun ve hücresel biyolüminesansı ölçün. Temozolomid'in antiglioblastom etkisini artırabilecek potansiyel adayları belirlemek için ilaç kombinasyonu taraması ile 20 hedef seçici küçük molekül inhibitörü analiz edildi. Hedeflenen 13 ajanın hassas indeks değerleri sıfırın üzerinde, beşi ise 0,1'in üzerindeydi.
İlk iki aday ilaç UMI-77 ve A 83-01'in hassas endeksi 0,25'ten yüksekti ve bu da temozolomid ile sinerji oluşturma potansiyellerini gösteriyor. Temozolomid ve UMI-77'nin kombine tedavisi altı ila altı doz titrasyon matrisinde anti-proliferatif bir test kullanılarak değerlendirildi. Birleşim dizin değerleri birden azdı.
Ve yüksek tek ajan değerleri, farklı konsantrasyonlarda temozolomid ve UMI-77 kombinasyonlarının çoğu için sıfırdan büyüktü. Hem XG387 hem de XG328 GSC'lerde temozolomid ve UMI-77'nin genel sinerjik etkileşimini önermektedir. Bu protokol, sadece plaka kaplama adımını çıkararak yapışık kanser hücreleri kullanılarak ilaç kombinasyonunun bulunmasında da uygulanabilir.
