환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

신경종 줄기 세포는 일반적으로 화학 요법과 방사선 요법에 저항하는 신경교종에 있는 세포의 하위 집단입니다. 여기서 우리는 분화된 신경교종 세포 대신 신경교종 줄기 세포를 표적으로 하는 조합 치료의 신속한 식별을 위한 방법을 기술했습니다. 힘들고 복잡할 수 있는 다른 방법에 비해.

이 프로토콜은 잠재적인 유용한 약물 조합을 식별 하기 위해 상대적으로 간단 하 고 빠른. 배양 배지에서 신경종 줄기 세포 또는 GSC를 수집하고 실온에서 3 분 동안 70 배 G로 원심분리하는 것으로 시작합니다. 상체를 제거 한 후, 섭씨 37도에서 4 분 동안 accutase로 세포를 소화하십시오.

200 마이크로리터 팁을 사용하여 세포를 반복적으로 피펫하여 분리하고 세포 펠릿을 재일시 중단합니다. GGSC를 배양 배지 1밀리리터에 200, 000셀의 밀도로 12개의 웰 배양판의 각 웰에 넣고 하룻밤 동안 배양합니다. 오 다음 날, 접시의 각 우물에 루시파라제-eGFP 바이러스 슈퍼나탈의 30 마이크로리터를 추가합니다.

2시간 동안 1000배 G의 세포를 원심분리하고 섭씨 25도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, GsCs를 수집하고, 원심분리하고, 상체를 제거하고, 신선한 매체로 재보딩하고, 이를 송환하여 우물의 매체를 교체한다. 다른 48 시간 동안 세포를 배양.

형광 현미경의 밑에 접시를 관찰하고 GFP 양성 세포의 외관을 확인합니다. 유동 셀 선별기를 사용하여 높은 형광으로 GSC를 분류하고 수집하여 더 배양합니다. 코트, 96 잘 광학 바닥 플레이트와 세포 외 매트릭스 혼합물, 같은 matrigel, 그리고 37 섭씨에서 1 시간 동안 그들을 배양.

여분의 혼합물을 제거하고 PBS로 한 번 플레이트를 부드럽게 헹구고, 배양 배지의 100 마이크로 리터에서 1000 세포의 밀도로 XG387-Luc 세포를 종자하고 코팅 된 플레이트의 각 우물에 밤새 배양하십시오. 다음 날, 현미경으로 세포를 관찰하여 플레이트에 부착하는 것을 확인하십시오. 다음으로 배양 배지에서 200마이크로몰러 테모졸로미드 용액과 표적 제제의 2개의 마이크로몰라 용액을 준비한다.

조합 약물 스크리닝의 경우, 빈 배지를 제거하고 200 마이크로몰라 테모졸로미드 또는 2개의 마이크로몰라 표적제를 포함하는 배지를 치료당 3개의 기술적 복제에 대해 각각의 웰에 추가한다. 3일 동안 37도, 이산화탄소 5%로 플레이트를 배양합니다. IVIS 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 플레이트내의 세포 생물 발광 의 이미지를 촬영합니다.

내장 소프트웨어를 사용하여 관심 영역의 여러 원형 영역을 만들고 세포 생물 발광을 정량화합니다. 테모졸로미드의 항교모세포종 효과를 향상시킬 수 있는 잠재적인 후보를 규명하기 위해, 20개의 표적 선택적 소분자 억제제는 약물 조합 스크리닝을 통해 분석되었다. 대상 에이전트 13개중의 민감한 인덱스 값은 0을 초과했으며 그 중 5개는 0.1을 초과했습니다.

상위 두 후보 약물 UMI-77 및 A 83-01의 민감한 지수는 0.25보다 높았으며 테모졸로미드와 시너지 효과를 낼 수 있는 잠재력을 시사했습니다. 테모졸로미드및 UMI-77의 결합된 치료는 6x6의 적정 매트릭스에서 항증식 분석체를 사용하여 평가하였다. 조합 인덱스 값이 하나 미만이었습니다.

그리고 높은 단일 제제 값은 다른 농도에서 테모졸로미드및 UMI-77의 조합의 대부분에 대해 0보다 컸다. XG387 과 XG328 GCS 모두에서 테모졸로미드와 UMI-77의 전반적인 시너지 상호 작용을 제안합니다. 이 프로토콜은 또한 단순히 플레이트 코팅 단계를 제거하여 부착 된 암세포를 사용하여 약물 조합을 찾는 데 적용 될 수있다.