Bu yazıda, klinik çevirisel boru hattının bir parçası olarak önemli etkinlik verileri sağlayabilen optimize edilmiş bir ex vivo insan derisi yaralama protokolü sunuyoruz. Bu tekniğin temel avantajı, canlı insan derisinde yara onarımının yüksek verimli doğru bir şekilde değerlendirilmesine izin veriyor olmasıdır. Prosedürü gösterenler doktora sonrası araştırmacı Elizabeth Roberts ve laboratuvarımızdan araştırma görevlisi Alexandria Kidd olacak.
Yara için bir cilt dokusu örneği hazırlamak için, cilt dermis tarafını 90 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve yağ dokusunu çıkarmak için steril makas kullanın. Tüm yağ çıkarıldığında, cildi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca antibiyotiklerle desteklenmiş 25 mililitre HBSS'ye yerleştirin ve yağ dokusundaki artık kanı çıkarmak için aralıklı sallama yapın. 10 dakika sonra cildi 25 mililitre DPBS'de durulayın.
10 dakika sonra, HBSS durulamayı antibiyotiksiz tekrarlayın ve ardından 25 mililitre DPBS'de son bir durulama yapın. Daha sonra emici ped yığınına steril bir naylon filtre zarı yerleştirin ve kalıntı DPBS'yi çıkarmak için cildin dermal tarafını steril gazlı bez üzerinde 90 milimetre petri kabında kurutun. Kurutulmuş cilt dermis tarafını, kalan DPBS'leri çıkarmak için temiz bir 90 milimetre Petri kabı kapağına yerleştirin ve epidermisi taze steril gazlı bezle kurutun.
Bir yara oluşturmak için, cildi sıkıca tutarken ve hafifçe bükülürken cilde iki milimetrelik bir biyopsi yumruğu bastırın. Kavisli dişli bir doku tokası kullanarak, yaklaşık iki milimetre çapında yaranın her iki tarafını alın ve yaranın altındaki kavisli Iris makasını bağlayın. Merkezde kısmi kalınlıkta iki milimetrelik bir yara ile altı milimetrelik bir eksplant oluşturmak için orta iki milimetrelik yaranın etrafında biyopsi yapmak için altı milimetrelik bir biyopsi yumruğu kullanın.
Daha sonra yara eksiz epidermis tarafını naylon filtre membran yığınına 32 ila 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir ila yedi günlük bir inkübasyon için yerleştirin. Floresan boyama için, yara eksplantlarını tüp başına 500 mikrolitre cilt fiksatifi içeren 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve eksplantları dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, fiksatifi bir mililitre boyama yıkama tamponu ile değiştirin.
Yıkamadan sonra, her numuneyi yaklaşık 150 mikrolitre bloke tamponu ile örtün ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Engelleme tamponu çıkarıldıktan sonra, tüp başına bloke tamponunda seyreltilmiş 150 mikrolitre birincil antikor ekleyin ve yarayı dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya bırakın. Ertesi sabah, numuneleri% 0.2 sodyum azit içeren 500 mikrolitre boyama yıkama tamponu ile durulayın ve ardından düzenli yıkama tamponunda üç durulayın.
Yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her kuyuya boyama yıkama tamponunda seyreltilmiş uygun floresan konjuge ikincil antikorun 150 mikrolitresini ekleyin. Kuluçkanın sonunda, her bir eksplantı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 150 mikrolitre DAPI ile lekelemeden önce, açıklayıcıyı yıkama başına 500 mikrolitrelik boyama yıkama tamponunda 30 dakika boyunca üç kez durulayın. Son olarak, explant'ı yıkama başına 500 mikrolitre yıkama tamponu ile 30 dakika boyunca iki kez yıkayın.
Eksplant görüntüleme için, konfokal mikroskop görüntüleme platformuna 60 milimetrelik bir Petri kabı yerleştirin ve yemeğe yaklaşık bir mililitre dpbs tabakası ekleyin. Yara eksplantlarını çanağa aktarmak için tokalar kullanın. Görüntüleme yazılımını deneye uygun şekilde kurduktan sonra, yarayı görüntüleme düzleminin ortasına yerleştirin ve yara biyopsilerinin görüntülerini alın.
Yüksek kaliteli görüntüleri uygun maliyetli bir şekilde elde etmek için kablosuz dijital mikroskop görüntülemesi yapmak için bir telefonu veya dizüstü bilgisayarı kablosuz dijital mikroskopa bağlayın. Eksplantların yara tarafını bir laboratuvar dokusunun üzerine yerleştirin ve numuneden kalan yıkama tamponlarını çıkarın. Ardından, explant'ı mikroskobun görüş alanının ortasına yerleştirin ve bağlı kamerayı kullanarak görüntüler elde edin.
İmmünperoksidaz ve immünofluoresans tüm montaj dokusu lekeleme için kullanılabilir. Ayrıca taze doku ve görüntülenmiş pre veya post-fiksasyon üzerinde canlı/ölü boyama yapılabilir. Yaraların tüm montaj lekesi, yara kapatma oranlarını tekrarlanabilir bir şekilde belirlemek için kullanılabilir.
Bu temsili analizde, diyabetik cilt yaraları yedi günlük analiz süresi içinde tam olarak kapanamazken, dört ila beş gün sonra sağlıklı cilt yarası kapanması gözlenmiştir. K14 ekspresyasyonu, epidermal farklılaşmanın artmasıyla hızla azalmadan önce sağlıklı cilt yaralarında ikinci günde zirve yaptı. Diyabetik cilt yaralarında bu yeniden epitelizasyon ve sonrasında epidermal farklılaşma gecikti.
Erken epidermal bariyerin reformu, farklılaştırılmış epidermal tabakalar içindeki K14 antikor penetrasyonunu dışlar. Yeniden epitelizasyon sürecinin başlarında, K14 pozitif bazal tabaka keratinositleri açık yaranın üzerine doğru göç eder, böylece dış yara kenarına daha yakın epidermis, iç yara kenarına daha yakın epidermisten daha erken oluşur. Onarım aşamasında, epidermisin dışarıdan içe doğru farklılaşmasıyla K14 lekelenme kaybolur.
Tüm montaj lekelenmesi, ciltteki diğer yara ile ilgili belirteçlerin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu ve iyileşmenin farklı aşamalarında yara bölgesinde ilgi çekici bağışıklık hücrelerinin varlığını incelemek için de kullanılabilir. Tekrarlanabilir eksizyonal yaralar üretmek ilk başta zor olabilir. Fazla deri kullanarak yaralama prosedürünü uygulamanızı tavsiye ederiz.
