本稿では、臨床翻訳パイプラインの一部として重要な有効性データを提供できる最適化されたex vivoヒト皮膚創傷プロトコルを提示する。この技術の主な利点は、生きている人間の皮膚における創傷修復の高スループットの正確な評価を可能にすることです。この手順を実証するのは、博士研究員のエリザベス・ロバーツと、私たちの研究室の研究助手であるアレクサンドリア・キッドです。
創傷のための皮膚組織サンプルを準備するには、皮膚真皮側を90ミリメートルのペトリ皿に下に置き、脂肪組織を取り除くために滅菌ハサミを使用します。すべての脂肪が取り除かれたら、脂肪組織の残留血液を除去するために断続的な揺れと室温で10分間抗生物質を補ったHBSSの25ミリリットルに皮膚を置く。10分後、25ミリリットルのDPBSで皮膚をすすいだ。
10分後、抗生物質を使わずにHBSSリンスを繰り返し、25ミリリットルのDPBSで最後のリンスを行います。その後、吸収性パッドスタックに滅菌ナイロンフィルター膜を置き、残留DPBSを除去するために90ミリメートルペトリ皿で滅菌ガーゼの皮膚の真皮側を乾燥させます。乾燥した皮膚真皮側を清潔な90ミリメートルのペトリ皿蓋の上に下に置き、残留DPBSを取り除き、新鮮な滅菌ガーゼで表皮を乾燥させます。
傷を作成するには、皮膚をしっかりと保持し、穏やかにねじりながら、皮膚に対して2ミリメートルの生検パンチを押してください。湾曲した歯付き組織鉗子を使用して、直径約2ミリメートルの傷口の両側を拾い、傷口の下に湾曲したアイリスはさみを引っ掛けます。6ミリメートルの生検パンチを使用して、中央の2ミリメートルの創傷の周りの生検を行い、中央に部分的な厚さ2ミリメートルの傷を負った6ミリメートルの外植を作成します。
その後、創傷外植表皮側をナイロンフィルター膜スタックの上に置き、摂氏32〜37度、炭酸ガス5%で1〜7日間のインキュベーションを行います。蛍光染色の場合は、1管あたり500マイクロリットルの皮膚固定剤を含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで創傷外植を収集し、4°Cで一晩植木物をインキュベートします。翌日、固定液を1ミリリットルの洗浄バッファーに交換します。
洗浄後、各サンプルを約150マイクロリットルのブロッキングバッファーで覆い、室温で1時間インキュベートします。ブロッキングバッファーを取り外した後、チューブ当たりのブロッキングバッファーで希釈した一次抗体の150マイクロリットルを加え、創傷外植を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、0.2%のアジドナトリウムを含む500マイクロリットルの染色洗浄バッファーでサンプルをリンスし、続いて通常の洗浄バッファーに3リンスを入れます。
洗浄後、洗浄バッファーを染色洗浄バッファーで希釈した適切な蛍光結合二次抗体の 150 マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で 1 時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、室温で150マイクロリットルのDAPIで各外植を反染色する前に、洗浄バッファーを洗浄ごとに500マイクロリットルで30分間30分間外植を洗い流します。最後に、1回の洗浄バッファー500マイクロリットルで30分間、外植を2回洗浄します。
外植イメージングの場合は、60ミリメートルのペトリ皿を共焦点顕微鏡のイメージングプラットフォームに配置し、約1ミリリットルのDPBS層を皿に加えます。鉗子を使用して、傷ついた外植物を皿に移します。実験に適したイメージングソフトウェアを設定した後、創傷を撮像平面の中央に配置し、創傷生検の画像を取得する。
ワイヤレスデジタル顕微鏡イメージングを実行して、費用対効果の高い方法で高品質の画像を取得するには、携帯電話またはラップトップをワイヤレスデジタル顕微鏡に接続します。外植をラボ組織の一部に上に置き、残りの洗浄バッファーをサンプルから取り除きます。次に、顕微鏡の視野の中央に外植を配置し、接続されたカメラを使用して画像を取得します。
免疫性ペルオキシダーゼおよび免疫蛍光は、全ての実装組織染色に使用することができる。さらに、生きた/死んだ染色は、新鮮な組織に対して行われ、予めまたは後の固定をイメージすることができます。創傷の全体のマウント染色は、再現可能な方法で創傷閉鎖率を決定するために使用することができる。
この代表的な分析では、健康な皮膚創傷閉鎖は4〜5日後に観察され、糖尿病性皮膚創傷は7日間の分析期間内に完全に閉じることができなかった。K14発現は、表皮分化の増加に伴って急速に減少する前に、健康な皮膚創傷で2日目にピークを迎えた。この再表皮化とその後の表皮分化は、糖尿病性皮膚創傷において遅れた。
初期表皮バリアの改変は、区別された表皮層内のK14抗体の浸透を排除する。再表皮化プロセスの初期に、K14陽性基底層角化細胞は開いた創傷の上に内側に移動し、外側の創傷端に近い表皮が内側の創傷端に近い表皮よりも早く形成される。修復段階の後半では、表皮が外側の内側から区別するので、K14染色は失われます。
全体のマウント染色はまた、皮膚の他の創傷関連マーカーの発現および局在化、ならびに治癒の異なる段階における創傷部位における目的の免疫細胞の存在を研究するために使用することができる。再現性の切除傷を発生させることは、最初は困難です。余剰肌を使って傷の手順を実践することをお勧めします。
