يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إصلاح الأنسجة وتجديدها حول الجمعيات بين مسارات cytoprotective, الإجهاد التأسدي, واستجابة التئام الجروح. الميزة الرئيسية لهذه التقنية القوية هي أنه يمكنك قياس أنواع الأكسجين التفاعلية في الجرح ، في الوقت الحقيقي ، لتحديد تأثيرها على تجديد الأنسجة. إثبات الإجراء معي ستكون جنيفر كوونغ، مساعدة باحثة في مختبري.
استخدام glucometer لقياس جلوكوز الدم من كل تخدير ثمانية إلى 12 ماوس السكري الأسبوع القديم. واستخدمي آلة تشذيب الشعر وكريم إزالة الشعر لإزالة الشعر الظهري من الحيوان الأول. استخدام مناديل الكحول مرتين لتنظيف الجلد المكشوفة والثناد الحيوان بحيث يتم كشف المنطقة الجراحية فقط.
عندما يجف الكحول، واستخدام اللكمات خزعة 10 ملليمتر معقمة لخلق اثنين، 10 ملليمتر كامل سمك الجروح تمتد من خلال carnosus panniculus وفقا لتقنية راسخة التئام الجروح الختان. استخدام ورقة سيليكون 0.5 ملليمتر سميكة مع 10 ملليمتر القواطع دائرية لتجبير الجروح مفتوحة وتأمين فترات مع انقطاع 4/0 خياطة الحرير. ثم ضع الفئران على وسادة حرارية مع المراقبة حتى الشفاء التام ، قبل العودة إلى قفصها الفردي ، وتوفير مناشف ورقية كمادة تعشيش إضافية لمدة أسبوعين.
في اليوم التالي، وتطبيق إما التحكم في هراء صغير يتدخل هلام RNA أو التجريبية الصغيرة تتدخل Keap1 هلام إلى الجزء العلوي من الجرح من كل والتفاف كل الجذع مع صلصة الفيلم شفافة للحفاظ على هلام في حين ترك الأطراف مجانا. في اليوم الثالث من التجربة، قم بتحميل حقنة ملليمتر واحد مجهزة بإبرة من عيار 27 مع محلول L-012 الذي تم إعداده حديثًا ولف الحقنة لحماية المحلول من الضوء. لتصوير الجروح ، قم بإزالة بلطف صلصة الفيلم الشفافة من كل من الفئران دون إزعاج الجروح ووضع الفئران في غرفة التصوير لنظام تصوير الإضاءة الحيوية.
تعيين تدفق نظام التصوير ومستويات الأوكسجين غرفة التعريفي إلى لتر واحد في الدقيقة وصورة الفئران عن طريق الإضاءة الحيوية والمجال الساطع في خط الأساس. المقبل، مسح البطن مع مناديل الكحول ثم حقن خمسة ملليغرام من حل L-012 لكل 200 غرام من وزن الجسم، IP، في كل فأرة مرة واحدة وقد جفت الكحول. حقن حل L-012 دون إزعاج الجروح على الجلد الظهري أمر بالغ الأهمية، لأن أي تشويه سوف يؤثر على مسار التئام الجروح وتفسير البيانات.
تأكد من أن الحيوان هو بأمان في إعادة شغل الظهر قبل الحقن. مباشرة بعد الحقن، ووضع الفئران مرة أخرى في مواقع كل منها في غرفة التصوير وصور الحيوانات لمدة دقيقة واحدة كل أربع دقائق على مدى فترة التصوير 60 دقيقة، وتحديد الجرح 10 ملليمتر كمنطقة ذات أهمية لتحديد مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية. ثم ضع الفئران على وسادة الحرارة مع مراقبة حتى الشفاء التام قبل إعادة الحيوانات إلى أقفاصها الفردية.
بعد ثلاثة أيام من خلق الجروح الثنائية وفقا لنموذج الجرح الختان المنشأة, لا يلاحظ التخمة الحيوية قبل حقن L-012. بعد الحقن محلول L-012 داخل اللمنتس، لوحظ الالواح الحيوية في مناطق الجرح حيث يتم الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية. تسجيل الإضاءة الحيوية لمدة دقيقة واحدة كل أربع إلى خمس دقائق على مدى 60 دقيقة يدل على التشبع الإنارة الحيوية للمنطقة ذات الاهتمام مع مرور الوقت، مع الوقت الأمثل للتصوير للوصول إلى تشبع L-012 كاملة لوحظ في حوالي 50 دقيقة.
يمكن بعد ذلك حساب الإضاءة الحيوية في كل منطقة جرح ذات أهمية قبل وبعد حقن L-012 في هراء تدخل الحمض النووي الريبي أو Keap1 صغير التداخل RNA الفئران المعالجة من خلال تقسيم إجمالي عدد كثافة الضوء من قبل المنطقة. تحليل اليوم 10 أقسام أنسجة الجرح لتأكيد دقة قياس مستوى الأكسجين التفاعلي من قبل H & E تلطيخ يكشف عن انخفاض تسلل الخلايا في الجروح المعالجة Keap1 التدخل الصغيرة بالمقارنة مع صغيرة تدخل هراء الأنسجة المعالجة، مما يدل على انخفاض المورفولوجيا الالتهابية في الحيوانات المعالجة هلام التجريبية. تحليل مناعية التفاعل من F4/80، وهو علامة الضامة البروتين على أقسام أنسجة الجرح، يشير إلى انخفاض عدد الضامة في الجروح المعالجة Keap1 التدخل صغيرة بالمقارنة مع الجروح الصغيرة التداخل معالجة هراء، مما يؤكد على صحة هذه الطريقة.
عند محاولة هذا الإجراء، تأكد من أن تأكيد L-012 لم تنته منتهية الصلاحية، ولتحريك الحل في مكان محمي من الضوء. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام مسابير مستهدفة وأساليب قائمة على أساس مناعي لدراسة التوطين شبه الخلوي لأنواع الأكسجين التفاعلية وترابطها، مما يتيح إجراء تقييم سريع للتدخلات والآليات التي تؤثر على إحصائيات الجروح.
