يتم استخدام زنوبرافت حمار وحشي على نطاق واسع لأبحاث السرطان. يمكنك أخذ خلايا الورم البشري وحقنه في سمك الحمار الوحشي الصغير ، أو حتى في البالغين. هنا ، ما نقدمه هو بروتوكول خطوة بخطوة لنموذج اليرقات ، حيث يمكننا دراسة العديد من السمات المميزة لسرطان الإنسان في حي.
يمكنك دراسة الانتشار، يمكنك دراسة تولد الأوعية، يمكنك دراسة الانبثاث، وأيضا التفاعلات داخل البيئة الدقيقة الورم. وميزة كبيرة هي أنه يمكنك دراسة هذا في إطار زمني قصير جدا. أربعة أيام فقط، على سبيل المثال.
ميزة أخرى كبيرة هي أنه يمكنك دراسة هذا العيش مع قرار خلية واحدة، وذلك باستخدام مجهر ورقة ضوء أو confocal. يمكنك دراسة كيفية هجرة الخلايا، أو كيفية تفاعل الخلايا مع بعضها البعض، أو حتى كيفية التحدث مع بعضها البعض. لذا فهو نموذج قوي حقا لدراسة بيولوجيا السرطان.
يمكن استخدام زنوبرافت حمار وحشي لدراسة الاستجابة للعلاجات المضادة للسرطان، مثل العلاج الكيميائي، والعلاج الإشعاعي، أو حتى العلاجات المستهدفة بالأجسام المضادة. وأخيرا، أيضا، يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لاستخدام الخلايا المشتقة من المريض من عينة جراحية، أو حتى من الخزعات، ومن ثم توليد الصور الرمزية حمار وحشي. إعداد للحقن.
قبل أسبوعين من الحقن، قم بتوسيع الخلايا في الثقافة. ابدأ بالخلايا الزائدة والأسماك الزائدة حتى تصبح بارعة في هذه التقنية ، حيث ستفقد العديد من الخلايا والأسماك أثناء التدريب. يحتوي الجدول الأول من PDF المصاحب على دليل مفصل للنسب المئوية المثلى للالتقاء في المختبر لحقن عدة خطوط خلوية.
قبل ثلاثة أيام من الحقن، عبر حمار وحشي من الخلفية المطلوبة. قبل 24 ساعة من الحقن. تنظيف لوحات جنين حمار وحشي.
تجاهل جميع الأجنة الميتة وغير المطورة وتحديث متوسط E3. في غرفة ثقافة الخلية، تجاهل الوسط ثقافة الخلية. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X لإزالة الخلايا الميتة وإضافة وسيطة جديدة.
قم بإعداد أدوات إجراء الحقن، مثل إبر الحقن المجهري، وصفائح الآجروز، ودبابيس الشعر لمحاذاة الأجنة للحقن. لإعداد لوحة، صب طبقة واحدة من 2٪ agarose الذائبة في غطاء طبق بيتري نظيفة. السماح لها بلمرة وبمساعدة مسطرة، وجعل ثلاثة إلى أربعة خطوط الآجروز على التوالي لمحاذاة الأجنة.
يوم الحقن فصل الأجنة المفقسة عن البويضات غير المفقسة. إضافة Pronase إلى وسيط الجنين في هذه المرحلة يمكن أن تعزز الفقس.
ضع الأجنة في الحاضنة عند 28 درجة مئوية حتى الحقن. وضع العلامات على الخلايا للحقن. للمساعدة في إنشاء تقنية وضع العلامات على الخلايا القابلة للاستنساخ، تحقق من الجدولين الأول والاثنين من البروتوكول المكتوب للحصول على تجميع لقائمة خطوط الخلايا والعديد من حلول وضع العلامات.
إزالة الخلايا الثقافة المتوسطة وغسل القارورة مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X. تسمية الخلايا مع صبغة ليبوفيلي، وتجنب التعرض للضوء، واحتضان قارورة في 37 درجة. يمكنك أيضا اختيار تسمية الخلايا في أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق عند الانفصال.
إزالة حل وضع العلامات الخلية وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X لإخراج الصبغة الزائدة. إضافة عامل مفرزة المقابلة، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية. تسهيل عملية مفرزة عن طريق تنظيف القارورة بمكشطة خلية معقمة وجمع الخلايا مع ماصة المصلية.
نقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل والطرد المركزي. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه مع خلية الثقافة المتوسطة. قياس صلاحية الخلية باستخدام غرفة نيوباور مع استبعاد الأزرق تريبان أو طريقة أخرى للاختيار.
الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في وسيط الحقن. يمكن العثور على تركيزات الخلايا الموصى بها في الوسط في الجدول الأول من المخطوطة. من هذه النقطة فصاعدا، يجب أن تبقى الخلايا على الجليد.
إجراءات الحقن. تخدير الأجنة في tricaine 1X لمدة 5 دقائق. ثم، نقل كمية صغيرة من الأجنة تخدير إلى لوحة agarose ومحاذاتها مع مساعدة من حلقة دبوس الشعر.
تأكد من الحفاظ على المسافة بين الأجنة. خصوصا بين صفار واحد ورأس واحد المقبل. لمنع الوفيات، تأكد من أن الأجنة المنحازة لا تجف في صفيحة الآجروز عن طريق إضافة قطرة واحدة إلى ثلاث قطرات من محلول tricaine 1X إلى اللوحة بعناية.
اضغط بخفة على أنبوب الطرد المركزي الدقيق لإعادة تعليق الخلايا. قم بتحميل إبرة الحقن بتعليق الخلية باستخدام طرف Microloader ، وتجنب فقاعات الهواء ، لأنها يمكن أن تعرض سلامة الأجنة للخطر. افتح صمام ضغط الهواء، واقام الحقن المجهري، وضع إبرة الحقن الدقيق بعناية في الحامل.
قطع إبرة الحقن المجهري على مقربة من الطرف. ثقب صفار الجنين بعناية ، وخفض زاوية الإبرة والدفع بحذر حتى يصل طرف الإبرة إلى الفضاء perivitelline. بمجرد أن يكون الطرف في الفضاء perivitelline، حقن الخلايا.
حاول حقن حجم من الخلايا مشابه لحجم عين الجنين، وبقدر الإمكان من القلب لمنع وذمة القلب. ضبط ضغط الميكروبيكتور، إذا لزم الأمر. نقل الأجنة المحقونة إلى طبق بيتري نظيفة مع الحل 1X tricaine وتركها للراحة لمدة خمس إلى 10 دقائق.
هذا سيعطي الجرح وقتا لإغلاقه إزالة الحل 1X tricaine وإضافة جديدة E3 المتوسطة. ثم، احتضان الأجنة في 34 درجة مئوية.
هذه الحرارة ستسمح ببقاء كل من أجنة الحمار الوحشي والخلايا السرطانية البشرية. المقايسة النقيلية. إذا كنت ترغب في دراسة الإمكانات النقيلية لخطوط الخلايا الخاصة بك، في حوالي ساعة واحدة بعد الحقن، فحص الأجنة المحقونة على مجسم مفلور، وفرزها إلى مجموعتين وفقا لعدم وجود أو وجود خلايا سرطانية في الدورة الدموية.
يوم واحد بعد الحقن. على مجسم مفلور، قم بتحليل كل جنين بعناية وحدد تلك التي تحتوي على أورام تم حقنها بشكل صحيح. فرز xenografts المحددة وفقا لحجم الورم.
استخدام حجم العين للمقارنة. تجاهل أي أجنة مع مورفولوجيا غير طبيعية، وذمة القلب أو صفار، xenografts مع عدد قليل جدا من الخلايا السرطانية، أو تلك التي مع الخلايا السرطانية فقط داخل صفار. توزيع xenografts وفقا للتخطيط التجريبي المطلوب وبدء المقايسة المخدرات.
استبدال الأدوية وE3 المتوسطة يوميا. احتضان xenografts، والحفاظ على درجة الحرارة من 34 درجة مئوية حتى نهاية المقايسة. أربعة أيام بعد الحقن.
في اليوم الأخير من الفحص ، تخدير xenografts مع حل tricaine 1X ، ومحاذاتها بعناية على لوحة أجار. تجاهل أي xenografts ميتة أو منتفخة. لا تعتبر هذه xenografts للقياس الكمي engraftment.
على مجسم مفلور، تحليل بعناية كل xenograft وتقييم غياب أو وجود الأورام في الفضاء perivitelline. وفقا لإعداد التجريبية، حدد xenografts من الفائدة والقتل الرحيم لهم مع tricaine 25X. إصلاحها في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 4 ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة للمضي قدما في التخدير المناعي.
خلاف ذلك، تخزين بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية وفي اليوم التالي، استبدال الفورمالديهايد مع الميثانول 100٪. يمكن تخزين Xenografts الثابتة في الميثانول 100٪ في 20 درجة إلى أجل غير مسمى. تركيب كامل مناعة للتصوير البؤري.
تستغرق تقنية الفلورة المناعية الكاملة ثلاثة أيام ، مقسمة على النحو التالي. اليوم الأول هو ل permeabilization من xenografts واحتضان الأجسام المضادة الأولية. في اليوم الثاني، لغسل والحضانة الأجسام المضادة الثانوية.
واليوم الثالث، لغسل، تثبيت xenografts والتخزين في المتوسط تصاعد. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول هذا الإجراء في PDF المصاحب. تصاعد من xenografts.
ختم حواف غطاء زلة مع هلام البترول أو الشحوم السيليكون، بحيث لا تسرب المتوسطة المتصاعدة. باستخدام ماصة باستور، نقل xenografts إلى زلة الغطاء. محاذاتها بعناية مع دبوس الشعر.
أضف وسيط التركيب إلى قسيمة غطاء أخرى. انضم بعناية إلى كل من زلات الغطاء ووضعها فوق شريحة المجهر للسماح بالتلاعب الأسهل. التصوير الكونفوشيكال.
عدسة الهدف الغمر 25X apochromatic مع تصحيح المياه هو الأمثل لتصوير الأورام مع قرار خلية واحدة. الحصول على عينات باستخدام الدالة Z-المكدس مع فاصل زمني من خمسة ميكرون بين كل شريحة. فتح البيانات الأولية في برنامج فيجي.
حدد ثلاث شرائح تمثيلية للورم من أعلى ووسط وأسفل، لكل z-كومة، لكل xenograft. فتح البرنامج المساعد عداد الخلية من برنامج فيجي. في أداة عداد الخلية، انقر فوق تهيئة، وحدد نوع العداد، وانقر على الصورة لبدء وضع العد يدويا.
لكل نقرة، يسأل العداد عن عدد الخلايا التي يتم حسابها. للحصول على العدد الإجمالي للخلايا في الورم، استخدم الصيغة التالية. لتقييم إجمالي الأرقام أو النسبة المئوية للعلامات ، مثل الخلايا المناعية ، والأرقام الميتوتيكية ، الكاسباز المنشط ، من بين أمور أخرى ، قم بتحديد الخلايا الإيجابية لوضع العلامات المحددة أو العلامة أو المتحولين جنسيا على طول جميع شرائح المكدس z مع المكون الإضافي ل Cell Counter.
يجب أن تدرك أن بعض الخلايا سوف تقع بين شريحتين. انتقل ذهابا وإيابا في المكدس z للتأكد من أنه يتم حساب أي خلية مرتين. النتائج التمثيلية.
HCT 116 تم إنشاء خط الخلايا السرطانية القولون والمستقيم xenografts كما هو موضح في البروتوكول. تم توزيع Xenografts عشوائيا في الضوابط غير المعالجة والعلاج الكيميائي FOLFIRI. تم إجراء الفلورة المناعية للكشف عن الخلايا المبرمج ، وذلك باستخدام الأجسام المضادة للكاسباس -3 المضادة للمشقوق وDAPI لاحتواء النوى.
كشف القياس الكمي للمؤشر الميتوتي ، موت الخلايا المبرمج ، وحجم الورم ، أن FOLFIRI يحفز انخفاضا كبيرا في الانقسام وتحريضا كبيرا من موت الخلايا المبرمج ، مصحوبا بانخفاض بنسبة 54٪ في حجم الورم. هذه الميزات مفيدة في شاشات الأدوية عالية الإنتاجية ، وكذلك لاختبار الآثار الجوهرية والفسيولوجية للخلية للعديد من علاجات السرطان في إطار زمني قصير. ميزة أخرى كبيرة لنموذج xenograft حمار وحشي هو أنه من الممكن لدراسة تفاعلات الخلايا السرطانية المختلفة وتحليل كيف يمكن لكل نوع من الخلايا التأثير على سلوك الآخر.
يمكن حقن خلايا سرطانية بشرية مختلفة، أو استنساخات مختلفة من نفس الورم، أو من أورام مختلفة. في هذا المثال، وصفت اثنين من خطوط الخلايا السرطانية القولون والمستقيم المستمدة من نفس المريض مع الأصباغ الدهنية المختلفة ومختلطة في نسبة واحد إلى واحد للحقن. نأمل أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين على أن يصبحوا خبراء حقيقيين في توليد زنوبرافت سمك الحمار الوحشي.
هذا ليس سهلا يجب أن تتدرب، تتدرب. لا تستسلمي، لا تستسلمي
أنا متأكد من أنك سوف تحصل هناك. حظ سعيد.
