Ксенотрансплантаты зебры широко используются для исследования рака. Вы можете взять опухолевые клетки человека и ввести его в маленьких личинок зебры, или даже во взрослых. Здесь мы представляем пошаговый протокол модели личинки, где мы можем изучить несколько признаков рака человека у живого животного.
Вы можете изучать пролиферацию, вы можете изучать ангиогенез, вы можете изучать метастазы, а также взаимодействия в микроокноронации опухоли. И большим преимуществом является то, что вы можете изучить это в очень короткие сроки. Всего четыре дня, например.
Другим большим преимуществом является то, что вы можете изучить это жить с разрешением одной клетки, используя конфокальный или световой микроскоп листа. Вы можете изучить, как клетки мигрируют, как клетки взаимодействуют друг с другом, или даже как они говорят друг с другом. Так что это действительно мощная модель для изучения биологии рака.
Ксенотрансплантаты зебры могут быть использованы для изучения реакции на противоакуковой терапии, как химиотерапия, лучевая терапия, или даже целевые терапии с антителами. И, наконец, этот протокол также может быть адаптирован для использования клеток, полученных пациентом из хирургического образца, или даже из биопсии, а затем генерировать аватары зебры. Настройка для инъекций.
За две недели до инъекции расширьте клетки в культуре. Начните с избытка клеток и избытка рыбы, пока не станет опытным с техникой, так как многие клетки и рыбы будут потеряны во время тренировки. Таблица 1 сопровождающего PDF содержит подробное руководство по оптимальным процентам слияния в пробирке для инъекций нескольких клеточных линий.
За три дня до инъекции пересеки зебру из нужного фона. За 24 часа до инъекции. Очистите пластины эмбриона зебры.
Отбросьте все мертвые и неразвитые эмбрионы и освежите E3 среды. В комнате культуры клетки, сбросьте средство культуры клетки. Вымойте один раз с PBS 1X, чтобы удалить мертвые клетки и добавить свежие среды.
Подготовь инструменты для процедуры инъекций, такие как микроинъекции иглы, агарозные пластины, и шпильки для выравнивания эмбрионов для инъекций. Для приготовления тарелки залить одним слоем растворенной 2%агарозы в крышку чистой чашки Петри. Пусть он полимеризируется и с помощью линейки, сделать три-четыре прямые линии агарозы для выравнивания эмбрионов.
День инъекций. Отделить вылупившихся эмбрионов от неугодных яйцеклеток. Добавление Pronase в среду эмбриона на данном этапе может увеличить штриховки.
Поместите эмбрионы в инкубатор при 28 градусах цельсия до инъекции. Маркировка клеток для инъекций. Чтобы помочь в создании воспроизводимой техники маркировки ячеев, проверьте таблицы один и два из письменного протокола для составления списка клеточных линий и нескольких решений маркировки.
Удалите среду клеточной культуры и дважды промыть колбу с помощью PBS 1X. Этикетка клеток с липофильным красителем, избегая воздействия света, и инкубировать колбу при 37 градусах. Вы также можете выбрать для обозначения клеток в 1,5 мл микроцентрифуг трубки при отслое.
Удалите раствор маркировки клеток и промыть клетки с PBS 1X, чтобы вынул избыток красителя. Добавьте соответствующий агент отряда и инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию. Облегчите процесс отслоения, чистя колбу стерильным клеточным скребок и собирайте клетки серологическим пипеткой.
Перенесите клетки на 1,5 мл микроцентрифугных трубок и центрифуг. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы средой клеточной культуры. Количественная жизнеспособность клеток с помощью камеры Neubauer с trypan синим исключением или другим методом выбора.
Центрифуга и повторно приостановить клетки в среде инъекции. Рекомендуемые концентрации клеток в среде можно найти в таблице одной из рукописей. С этого момента клетки должны оставаться на льду.
Процедуры инъекций. Анестезия эмбрионов в трикаине 1X в течение 5 минут. Затем перенесите небольшое количество анестезировах эмбрионов на агарозную пластину и выровняйте их с помощью петли шпильки.
Убедитесь в том, чтобы сохранить расстояние между эмбрионами. Особенно между желтком одного и головой следующего. Чтобы предотвратить смертность, убедитесь, что выровненные эмбрионы не высыхают в агарозной пластине, тщательно добавляя одну-три капли трикаина 1X раствора пластины.
Слегка коснитесь микроцентрифугной трубки, чтобы повторно приостановить работу клеток. Загрузите инъекционной иглой с клеточной подвеской с помощью наконечника Микрозагрузщика, избегая пузырьков воздуха, так как они могут поставить под угрозу целостность эмбрионов. Откройте клапан давления воздуха, навелите микроинъектор и аккуратно поместите микроинъекцию иглы в держатель.
Вырезать микроинъекции иглы близко к кончику. Тщательно прокалывайте желток эмбриона, опуская угол иглы и осторожно нажимая, пока кончик иглы не достигнет перивителлина пространства. Как только кончик находится в перивителлиновом пространстве, ввимите клетки.
Попробуйте ввести объем клеток, похожий на размер глаза эмбриона, и, насколько это возможно от сердца, чтобы предотвратить отек сердца. При необходимости отрегулируйте давление микроинъектора. Перенесите вводимые эмбрионы в чистую чашку Петри с раствором трикаин 1X и оставьте их на отдых на 5-10 минут.
Это даст ране время, чтобы закрыть. Удалите раствор tricaine 1X и добавьте свежий E3 средний. Затем инкубировать эмбрионы при 34 градусах по Цельсию.
Эта температура позволит выжить как эмбрионам зебры, так и опухолевым клеткам человека. Метастатический анализ. Если вы хотите изучить метастатический потенциал клеточных линий, примерно через час после инъекции, экран вводили эмбрионы на флуоресценции стереомикроскоп, и сортировать их на две группы в зависимости от отсутствия или присутствия раковых клеток в обращении.
Однажды после инъекций. На стереомикроскопе флуоресценции тщательно проанализируйте каждый эмбрион и выберите тех, у кого правильно вводили опухоли. Сортив выбранные ксенотранспланты в зависимости от размера опухоли.
Используйте размер глаза для сравнения. Отбросьте любые эмбрионы с аномальной морфологией, сердечным или желтковых отеков, ксенотрансплантатов с очень немногими раковыми клетками, или те, с раковыми клетками только внутри желтка. Распределить ксенотранспланты в соответствии с желаемой экспериментальной компоновкой и начать анализ препарата.
Заменить препараты и E3 среды ежедневно. Инкубировать ксенотрансплантаты, сохраняя температуру 34 градусов по Цельсию до конца анализа. Четыре дня после инъекции.
В последний день анализа, анестезировать ксенотрансплантатов с tricaine 1X раствор, и тщательно выровнять их на агар пластины. Откажитесь от мертвых или опухших ксенотрансплантатов. Эти ксенотрансплантаты не считаются количественной оценкой.
На стереомикроскопе флуоресценции тщательно проанализируйте каждый ксенотрансплантатор и оцените отсутствие или наличие опухолей в перивителлиновом пространстве. В соответствии с экспериментальной установки, выберите ксенотрансплантаты интереса и усыпить их с tricaine 25X. Исправить их в 4%формальдегида, по крайней мере 4 часа при комнатной температуре, чтобы приступить к иммуностимулятора.
В противном случае, хранить на ночь при четырех градусах по Цельсию и на следующий день, заменить формальдегид 100%метанол. Ксенотранспланты, зафиксированные в 100%-х метаноле, могут храниться при 20 градусах бесконечно. Целый монтировать иммуностимулятор для конфокальных изображений.
Вся техника иммунофторесценции монтируется три дня, разделенная следующим образом. Первый день для проницаемой ксенотрансплантатов и первичной инкубации антител. Второй день, для мытья и вторичной инкубации антител.
И третий день, для мытья, фиксации ксенотрансплантатов и хранения в монтажной среде. Более подробную информацию об этой процедуре можно найти в сопроводительном PDF. Монтаж ксенотрансплантатов.
Печать края крышки скольжения с вазелин или силиконовой смазки, так что монтаж среды не протекает. Используя пипетки Pasteur, перенесите ксенотранспланты на крышку скольжения. Аккуратно выровняйте их с помощью шпильки.
Добавьте крепления среды к другой крышке скольжения. Тщательно присоединяйтесь к обеим крышка скользит и поместите их на верхней части слайда микроскопа, чтобы облегчить манипуляции. Конфокальные изображения.
Апохроматическое 25X погружение объектив с коррекцией воды является оптимальным для визуализации опухолей с разрешением одной клетки. Приобретайте образцы с помощью функции «К-Стек» с интервалом в пять микрон между каждым срезом. Откройте необработанные данные в программном обеспечении Фиджи.
Выберите три репрезентативных ломтика опухоли сверху, посередине и снизу, по z-стеку, по ксенотрансплантату. Откройте плагин Cell Counter от программного обеспечения Фиджи. В инструменте Cell Counter нажмите Initialize, выберите тип счетчика и нажмите на изображение, чтобы начать режим подсчета вручную.
За каждый клик счетчик спрашивает, сколько ячеек подсчитано. Чтобы получить общее количество клеток в опухоли, используйте следующую формулу. Для оценки общего числа или процента маркеров, таких как иммунные клетки, митотические фигуры, активированная каспазы, среди прочего, количественно вручную клетки, которые являются положительными для конкретной маркировки, маркер или трансген интереса по всем ломтикам z-стек с плагином Cell Counter.
Имейте в виду, что некоторые ячейки будут расположены между двумя ломтиками. Идите туда и обратно в z-стек, чтобы убедиться, что ни одна ячейка не считается в два раза. Результаты представительов.
HCT 116 колоректального рака клеточной линии ксенотрансплантата были созданы, как описано в протоколе. Ксенотрансплантанты были случайным образом распределены в необработаемых контролях и химиотерапии FOLFIRI. Иммунофторесценция была выполнена для обнаружения апоптотических клеток, используя антитела к каспазе-3 и DAPI для нуклеического противопехотного лечения.
Количественная оценка митотического индекса, апоптоза и размера опухоли показала, что ФОЛФИРИ вызывает значительное снижение митоза и значительное индукцию апоптоза, сопровождаемое 54%-ным уменьшением размера опухоли. Эти функции полезны в высокой пропускной способности фенотипических экранов наркотиков, а также для проверки клеток внутреннее и физиологическое воздействие нескольких методов лечения рака в короткие сроки. Еще одним большим преимуществом модели ксенотрансплантата зебры является то, что можно изучить взаимодействия различных опухолевых клеток и проанализировать, как каждый тип клетки может влиять на поведение другого.
Различные раковые клетки человека, различные клоны из одной и той же опухоли, или из разных опухолей, могут быть совместно введены. В этом примере две линии колоректального рака, полученные от одного и того же пациента, были помечены различными липофильными красителями и смешаны в соотношении один к одному для инъекций. Мы надеемся, что этот протокол поможет исследователям стать настоящими экспертами в генерации ксенотрансплантатов зебры.
Это не просто. Тебе нужно тренироваться, тренироваться. Не сдавайтесь.
Я уверен, что вы получите там. Удачи.
