يقدم البروتوكول التالي كيفية إعداد تجربة صدى الدوران النيوتروني لقياس دالة التشتت الوسيطة والتحقيق في ديناميكيات البروتينات في المحلول. الميزة الرئيسية للتحليل الطيفي للصدى النيوتروني Spin هي قدرته على النظر في إعادة ترتيب مجالات البروتين والمجالات الفرعية على مقياس بيكو إلى نانو ثانية ؛ وهو نطاق الحركات البطيئة في البروتينات في بيئتها الطبيعية تقريبا ، وفي محلول البروتين المزدحم. كما أن صدى الدوران النيوتروني حساس أيضا للتكوين النظيري ، مما يسمح بإجراء دراسات محددة للغاية ومستهدفة باستخدام مطابقة التباين.
تعد الرؤى حول ديناميكيات مجال البروتين جزءا رئيسيا من الأبحاث الفيزيائية الحيوية في المهمة الصعبة المستمرة لنقل حركات مجال البروتينات بوظائفها البيولوجية. يمكن تطبيق البروتوكول المعروض هنا بشكل عام على أي قياس صدى دوران نيوتروني يتم إجراؤه في مطياف SNS-NSE ، بغض النظر عن اختيارك للعينات ، إذا بقي المرء داخل عالم مواد المادة اللينة. لإعداد التجربة ، ابدأ بتحديد سمك تحميل عينة الخلية ، بناء على تركيز عينة البروتين ، ودرجة الحرارة اللازمة للقياس ، وكمية المحلول المتاح.
نظف الخلية باستخدام منظفات الأطباق الخالية من الفوسفات والماء منزوع الأيونات و 70٪ من الديثانول. جفف الخلية في فرن الحمل الحراري. قم بتحميل أربعة ملليلترات من محلول البروتين في الخلية ، وأغلقها بأغطية.
استخدم فيلم الشمع أو أي مادة مانعة للتسرب لإغلاق خلايا العينة. قم بتحميل أربعة ملليلترات من المخزن المؤقت لغسيل الكلى في حاوية مماثلة لعينة البروتين وختمها. نقل العينات إلى خط الحزمة.
أغلق الغالق، وأدخل منطقة كهف حاوية مقياس الطيف. قم بتركيب خلية العينة على حامل عينة الألومنيوم عن طريق تشديد البراغي وألواح الانتظار. قم بتركيب عينة الجرافيت وعينة مسحوق أكسيد الألومنيوم المحملة في حاوية مماثلة لعينة البروتين.
ضع نفس الحامل عن طريق تحريكه برفق في علبة نظام فرض درجة الحرارة. أغلق غطاء نظام فرض درجة الحرارة ، واضبط درجة الحرارة على القيمة المطلوبة من خلال الوصول إلى الشاشة التفاعلية لنظام فرض درجة الحرارة. قم بتركيب الكاميرا النيوترونية لمحاذاة العينات مع الحزمة.
لجمع بيانات التحليل الطيفي للصدى النيوتروني الدوار، قم بمحاذاة العينة في الحزمة النيوترونية باستخدام الكاميرا النيوترونية، وفتحات العينة الأربعة المستقلة. افتح مصدر النيوترون التباعدي ، وبرنامج جمع بيانات التحليل الطيفي للصدى النيوتروني ، وجمع إحصائيات العينات عن طريق تشغيل عمليات مسح الانكسار لزوايا التشتت والطول الموجي المطلوبين. قم بإعداد معلمات القياس استنادا إلى الإحصاءات التي تم جمعها لكل عينة عن طريق تحرير وحدات ماكرو القياس التي يقدمها عالم الأدوات المساعدة.
ابدأ المسح الضوئي عن طريق كتابة اسم البروتوكول في موجه الأوامر والحصول على أصداء للعينة. قم بتسجيل الدخول إلى مجموعة التحليل عن بعد للعلوم النيوترونية باستخدام بيانات اعتماد مستخدم ORNL واضغط على زر بدء الجلسة. في دليل المستخدم، افتح نافذة طرفية واكتب أمر إعداد البرنامج.
بعد ذلك، اكتب الأمر البيئة. قم بإنشاء مجلد لتقليل البيانات في الدليل الرئيسي وانسخ البرامج النصية ووحدات الماكرو المتوفرة من الدليل المشترك. قم بتحرير ماكرو التخفيض المقدم وإعادة تسميته وحفظه وفقا لذلك.
اكتب drspine"في موجه الأوامر واضغط على Enter لبدء بيئة تقليل البرامج. اكتب اسم ماكرو الاختزال في موجه الأوامر داخل بيئة البرامج، ثم اضغط على Enter. قم بتحرير البرنامج النصي Python الذي يوفره عالم الأدوات المساعدة مع أسماء بيانات الملف المخفضة.
قم بتحرير الوظيفة لتناسب من المكتبة المتوفرة. اكتب اسم البرنامج النصي الذي تم تحريره في موجه الأوامر، ثم اضغط على Enter لقراءة بيانات NSE المخفضة وملاءمتها ورسمها. تظهر دالة التشتت الوسيطة التي تم قياسها بواسطة NSE لبروتينات IgG و MBP انحرافا واضحا عن عملية استرخاء بسيطة تشبه الانتشار على مقياس زمني قصير مدته أربع سنوات ، مما يشير إلى إمكانية الوصول إلى الديناميكيات الداخلية للبروتين بواسطة NSE ، والحاجة إلى نموذج أكثر تعقيدا لوصف العمليات الديناميكية المرصودة.
كانت نتائج حسابات دالة التشتت الوسيطة التي تم تركيبها بواسطة النمذجة الذرية لكلا البروتينين باستخدام النماذج التي طورتها متفقة بشكل ممتاز مع بيانات NSE التجريبية. أثبتت النتائج أن الديناميكيات الأبطأ التي لوحظت في أوقات الفراء الأطول يمكن أن تعزى إلى عمليات الانتشار الانتقالية والدورانية الشاملة ، في حين أن الديناميكيات التي لوحظت في المقاييس الزمنية القصيرة يمكن أن تعزى إلى ديناميكيات مجالات البروتين. أحد الأشياء المهمة التي يجب تذكرها هو الحاجة إلى عينات جيدة الإعداد ونظيفة لقياسات NSE.
تحتوي العينة الجيدة ل Spin Echo على نسبة قلب أعلى من ثلاثة ، وهي النسبة بين التشتت المتماسك وغير المتماسك للعينة. أيضا أثناء تحضير العينة وتحميل العينات في خلايا NSE ، يجب الحفاظ على محلول العينة آمنا وخاليا من أي تلوث كيميائي أو بيولوجي متقاطع. ولأسباب تتعلق بالسلامة، لا ينبغي محاولة الدخول إلى حاوية المطياف إلا بعد إغلاق الغالق، ويسمح بنصف ساعة إضافية للتبريد الإشعاعي للحاوية.
يوصى باستخدام تشتت النيوترون صغير الزاوية لتقييم شكل وبنية البروتينات في محلول مركز. يمكن القيام بذلك قبل أو بالتوازي مع تجربة NSE. توفر الطرق الإضافية مثل تشتت الضوء الديناميكي وقياسات اللزوجة معلومات حول الانتشار الانتقالي والتفاعل الهيدروديناميكي داخل محلول البروتين المركز ، ويوصى بها أيضا.
