هذا البروتوكول مهم للغاية لأنه يمثل أحدث سير العمل للتحليل العالمي لمثيلة البروتين أرجينين بواسطة قياس الطيف الكتلي. هذه هي الطريقة الوحيدة لتحديد وتعريف البروتين R-methylated بدقة نمط واحد لا يمكن تحقيقها باستخدام التقنيات الكيميائية الحيوية الأخرى. عندما يقترن هذا البروتوكول باستخدام مثبطات PRMT ، والعديد منها في التجارب السريرية والأدوية المضادة للسرطان ، يسمح هذا البروتوكول بإجراء تحليل متعمق لآلية عملها.
للبدء ، قم بإجراء تقليل مجموعة الثيول من البروتينات باستخدام محلول مخزون من DTT مذاب في ماء فائق النقاء بتركيز نهائي قدره 4.5 مليمولار واترك التفاعل لمدة 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية. أداء الألكلة من مجموعة ثيول من البروتينات عن طريق إضافة يودواسيتاميد بتركيز 10 مليمولار واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. للتحقق من كفاءة التحلل البروتيني ، احفظ حصة من مستخلص البروتين للتحليل اللاحق على جل SDS-PAGE Coomassie الملون ومقارنته بكمية مقابلة من العينة عند الهضم.
قم بتخفيف مستخلص البروتين المتبقي بأربعة مجلدات من 20 ملليمولار HEPES عند درجة حموضة 8.0 للوصول إلى تركيز اليوريا النهائي من اثنين من الضرس. قسم العينة إلى جزأين ، ثم أضف التربسين المعدل بدرجة التسلسل إلى أحدهما وبروتياز LysargiNase إلى الآخر. اترك العينات طوال الليل عند 37 درجة مئوية في ThermoMixer بمعدل 600 دورة في الدقيقة للسماح بالهضم الأنزيمي.
لكل تدرج كروماتوغرافي ، اجمع كل الكسور في لوحة عميقة من 96 بئرا. قم بتجميع الكسور التي تم جمعها قبل بدء التدرج في كسر واحد يسمى pre. قم بربط 60 كسرا من التدرج اللوني الكروماتوجرافي السائل المعكوس ذو الأس الهيدروجيني العالي عن طريق تجميعها بطريقة غير متجاورة في 14 كسرا نهائيا.
للحصول على تسلسل غير متجاور ، قم بتجميع كسور الطور المعكوسة ذات الأس الهيدروجيني العالي كما هو موضح في مخطوطة النص. قم بتجميع الكسور التي تم جمعها بعد التدرج في كسر فريد يسمى post. إجراء إثراء متسلسل بالتقارب المناعي للببتيد المعدل بشكل منفصل للعينتين من هضم التربسين و LysargiNase.
تمييع تنقية التقارب المناعي المركز 10X أو العازلة IAP 10 مرات. جهاز طرد مركزي للببتيدات المجففة بالتجميد عند 2،000 جم لمدة خمس دقائق لتدوير الببتيدات إلى أسفل الأنبوب. أعد تعليق الببتيدات ب 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المخفف IAP لكل أنبوب سعة 15 ملليلتر وانقله إلى أنبوب ربط منخفض سعة 1.5 ملليلتر.
استخدم ورقة عباد الشمس للتحقق من أن الرقم الهيدروجيني أكبر من ستة. احتفظ بقسمة صغيرة من كل كسر كمدخل لتحليل MS اللاحق. قسم كل جزء إلى جزأين لإجراء التخصيب المناعي للببتيدات ثنائية الميثيل غير المتماثلة ، أو ADMA ، وثنائي الميثيل المتماثل ، أو SDMA ، بالتوازي.
تحضير ثلاث قوارير من الأجسام المضادة المختارة المضادة لعموم R-methylated مترافقة مع حبات البروتين A agarose لكل 10 ملليغرام من مستخلص البروتين الأولي. قم بإعداد الكمية الصحيحة من الأجسام المضادة المترافقة مع حبات الأغاروز عن طريق طرد كل قارورة بالطرد المركزي عند 2،000 G لمدة 30 ثانية وإزالة المخزن المؤقت من الخرزات. اغسل الخرز ثلاث مرات بملليلتر واحد من 1X PBS عن طريق الطرد المركزي عند 2،000 G لمدة 30 ثانية.
بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخرز في 40 ميكرولتر 1X PBS لكل قارورة ، وقم بتجميعها ثم قسمها أخيرا بالتساوي إلى 16 كسرا. أضف 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1X IAP إلى كل أنبوب واخلطه عن طريق التقليب. ثم احتضان الأنابيب على عجلة دوارة لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب سعة 1.5 ملليلتر التي تحتوي على الببتيدات وحبيبات الجسم المضاد R-methyl المترافقة عند 2،000 G لمدة 30 ثانية لحبيبات الخرز ونقل التدفق من كل جزء إلى أنبوب ربط منخفض نظيف 1.5 ملليلتر. أضف الخرزات إلى التدفق المترافق مع الأجسام المضادة ضد مثيلة R-mono وكرر إعادة التعليق في PBS ، والحضانة باستخدام المخزن المؤقت IAP ، والطرد المركزي. أثناء حضانة عينات الببتيد مع حبات أحادية الميثيل أو MMA ، اغسل الكسور التي كانت مترسبة سابقا بمضادات ADMA و SDMA باستخدام 250 ميكرولتر من محلول IAP مرتين وتخلص من المادة الطافية بعد كل غسلة.
ثم يغسل بالماء LC-MS ثلاث مرات. تخلص من ببتيدات SDMA أو ADMA المخصبة بالتقارب من حبات الأغاروز بإضافة 50 ميكرولتر من 0.15 TFA إلى كل أنبوب. اترك هذا المحلول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واقلب الأنابيب كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
انقل الشطف الأول إلى أنابيب منخفضة الربط نظيفة سعة 1.5 ملليلتر وكرر الشطف باستخدام 50 ميكرولتر من 0.15 TFA. قم بتجميع جزأي الشطف في أنبوب واحد. كرر هذه العملية مع الببتيدات R-mono-methylated التي تم تحضينها مع حبات الأجسام المضادة ل MMA.
بعد خلط الخلايا الخفيفة والثقيلة ، تم استخراج البروتينات وتعريضها للهضم بواسطة التربسين و LysargiNase. تم استخدام هلام SDS-PAGE Coomassie الملون للتحقق من الهضم الأنزيمي الفعال للبروتينات الكلية في الببتيدات. تم تقييم كفاءة خطوة التنقية التي قام بها عمود C18 Sep-Pak ، مما يؤكد عدم وجود الببتيدات في تدفق العمود C18 وفي الغسيل الأول والثاني بالإضافة إلى وجودها المتوقع في المحلول .
تم تقييم الدمج الصحيح ل MET4 في القناة الثقيلة والخلط الثقيل أو الخفيف الصحيح. يوضح هنا مخطط كروماتوجرام الكروماتوغرافيا المتغيرة للببتيدات ذات الأس الهيدروجيني المرتفع غير المتصل بالإنترنت وسلسلة الكسور غير المتجاورة اللاحقة. تم الكشف عن الببتيدات بواسطة 250 نانومتر من الأشعة فوق البنفسجية ، في حين تم تقييم البروتينات غير المهضومة المتبقية بواسطة 280 نانومتر من الأشعة فوق البنفسجية. تم الحصول على أطياف MS الكاملة للببتيدات التي تمثل شرحا إيجابيا حقيقيا لببتيد الميثيل.
تتوافق الاختلافات M على Z التي لوحظت بين القمم الثلاث مع وجود بقايا ميثلية إنزيمية. تم الحصول على أطياف MS الكاملة للببتيدات التي تمثل شرحا إيجابيا كاذبا لببتيد الميثيل. الاختلافات M على Z التي لوحظت بين الببتيد الميثيلي الخفيف ونظيره الثقيل العقابي ينحرف عن القيمة المتوقعة بمقدار 0.0312.
سير عمل البروتوكول خطي بشكل عام ، ولكن هناك بعض الخطوات التي تحتاج إلى عناية خاصة. على سبيل المثال ، فصل كروماتوغرافيا IPH مع تسلسل الكسر غير المتجاور ، وكذلك إعداد IP. يمكن أن يقترن نفس البروتوكول إما بمعيار SILAC أو القياس الكمي الخالي من الملصقات لتحديد ديناميكيات مثيلة الأرجينين استجابة لمجموعة متنوعة من الاضطرابات.
يمهد هذا البروتوكول الطريق لتوصيف مدى وديناميكيات مثيلة البروتين في العديد من أنواع الخلايا وأنظمة النماذج التي تدعم جميع جوانب البحوث الأساسية والانتقالية التي تركز على PRMTs.
