Este protocolo es muy significativo porque representa el flujo de trabajo de vanguardia para el análisis global de la metilación de la proteína arginina por espectrometría de masas. Este es el único método para identificar y perfilar la proteína R-metilada con una resolución de estilo único que no se puede lograr con otras técnicas bioquímicas. Cuando se combina con el uso de inhibidores de PRMT, varios de los cuales se encuentran en ensayos clínicos y medicamentos contra el cáncer, este protocolo permite un análisis en profundidad de su mecanismo de acción.
Para comenzar, realice la reducción del grupo tiol de proteínas utilizando una solución madre de DTT disuelta en agua ultrapura a una concentración final de 4,5 milimolares y deje ir la reacción durante 30 minutos a 55 grados centígrados. Realice la alquilación del grupo tiol de proteínas agregando yodoacetamida a una concentración de 10 milimolares e incubando durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Para verificar la eficacia de la proteólisis, guarde una alícuota de extracto de proteína para su posterior análisis en el gel teñido con Coomassie SDS-PAGE y compárelo con una cantidad correspondiente de muestra durante la digestión.
Diluir el extracto proteico restante con cuatro volúmenes de 20 HEPES milimolares a pH 8.0 para alcanzar una concentración final de urea de dos molares. Divida la muestra en dos partes, luego agregue tripsina modificada de grado de secuenciación a una y proteasa LysargiNase a la otra. Deje las muestras durante la noche a 37 grados centígrados en un ThermoMixer a 600 rotaciones por minuto para permitir la digestión enzimática.
Para cada gradiente cromatográfico, reúna todas las fracciones en una placa profunda de 96 pocillos. Agrupe las fracciones recogidas antes del inicio del gradiente en una sola fracción denominada pre. Concatenar las 60 fracciones del gradiente cromatográfico líquido de fase inversa de pH alto agrupándolas de forma no contigua en 14 fracciones finales.
Para obtener una concatenación no contigua, agrupe las fracciones de fase invertida de pH alto como se describe en el manuscrito de texto. Agrupe las fracciones recogidas después del gradiente en una fracción única denominada post. Realizar el enriquecimiento secuencial de inmunoafinidad del péptido modificado por separado para las dos muestras de tripsina y LysargiNase digestiones.
Diluir la purificación de inmunoafinidad concentrada 10X o el tampón IAP 10 veces. Centrifugar los péptidos liofilizados a 2, 000 G durante cinco minutos para girar hacia abajo los péptidos hasta el fondo del tubo. Resuspender los péptidos con 250 microlitros de tampón IAP diluido por tubo de 15 mililitros y transferir a un tubo de unión baja de 1,5 mililitros.
Use un papel tornasol para verificar que el pH sea mayor que seis. Mantenga una pequeña alícuota de cada fracción como entrada para el posterior análisis de EM. Dividir cada fracción en dos partes para realizar el enriquecimiento inmunológico de péptidos asimétricamente dimetilados, o ADMA, y simétricamente dimetilados, o SDMA, en paralelo.
Prepare tres viales de los anticuerpos anti-pan R-metilados seleccionados conjugados con perlas de agarosa de la proteína A por 10 miligramos del extracto de proteína inicial. Prepare la cantidad correcta de anticuerpo conjugado con perlas de agarosa centrifugando cada vial a 2, 000 G durante 30 segundos y retirando el tampón de las perlas. Lave las perlas tres veces con un mililitro de 1X PBS centrifugando a 2, 000 G durante 30 segundos.
Después del último lavado, resuspender las perlas en 40 microlitros 1X PBS para cada vial, agruparlas y finalmente dividirlas en partes iguales en 16 fracciones. Agregue 250 microlitros de tampón 1X IAP a cada tubo y mezcle invirtiendo. Luego incubar los tubos en una rueda giratoria durante dos horas a cuatro grados centígrados.
Después de la incubación, centrifugar los tubos de 1,5 mililitros que contienen péptidos y perlas conjugadas de anticuerpos Pan-R-metilo a 2, 000 G durante 30 segundos para granular las perlas y transferir el flujo de cada fracción a un tubo limpio de 1,5 mililitros de baja unión. Agregue las perlas al flujo conjugado con anticuerpos contra la metilación R-mono y repita la resuspensión en PBS, la incubación con tampón IAP y la centrifugación. Durante la incubación de las muestras de péptidos con perlas de monometilación o MMA, lavar las fracciones que fueron previamente inmunoprecipitadas con anti-ADMA y SDMA con 250 microlitros de tampón IAP dos veces y desechar el sobrenadante después de cada lavado.
Luego lavar con agua de grado LC-MS tres veces. Eluya los péptidos SDMA o ADMA enriquecidos con afinidad de las perlas de agarosa agregando 50 microlitros de 0.15 TFA a cada tubo. Deje esta solución durante 10 minutos a temperatura ambiente, invirtiendo los tubos cada dos o tres minutos.
Transfiera la primera elución a tubos limpios de 1,5 mililitros de baja unión y repita la elución con 50 microlitros de 0,15 TFA. Agrupe las dos fracciones de elución en un tubo. Repita este proceso para los péptidos R-monometilados que se incubaron con las perlas de anticuerpos anti-MMA.
Después de mezclar las células marcadas ligeras y pesadas, las proteínas se extrajeron y se sometieron a la digestión por tripsina y LysargiNase. Se utilizó un gel teñido con Coomassie SDS-PAGE para verificar la digestión enzimática eficiente de las proteínas totales en péptidos. Se evaluó la eficiencia de la etapa de purificación realizada por la columna C18 Sep-Pak, confirmando la ausencia de péptidos en el flujo de la columna C18 y en el primer y segundo lavado, así como su presencia esperada en el eluyente.
Se evaluó la correcta incorporación de MET4 en el canal pesado y la correcta mezcla pesada o ligera. Aquí se muestra el cromatograma del fraccionamiento de péptidos por cromatografía líquida de fase inversa de pH alto fuera de línea y la posterior concatenación no contigua de fracciones. Los péptidos fueron detectados por 250 nanómetros UV, mientras que las proteínas potencialmente restantes no digeridas fueron evaluadas por 280 nanómetros UV. Se obtuvieron los espectros completos de MS de péptidos que representan la verdadera anotación positiva del péptido metílico.
Las diferencias M sobre Z observadas entre los tres picos son consistentes con la presencia de residuos metilados enzimáticamente. Se obtuvieron los espectros completos de MS de péptidos que representan la anotación de péptido metílico falso positivo. Las diferencias M sobre Z observadas entre el péptido metilado ligero y su contraparte pesada punitiva se desvían del valor esperado en 0.0312.
El flujo de trabajo del protocolo es lineal en general, pero hay algunos pasos que requieren atención especial. Por ejemplo, la separación por cromatografía IPH con concatenación de fracciones no contiguas, así como la configuración IP. El mismo protocolo se puede acoplar a SILAC estándar o cuantificación sin etiqueta para perfilar la dinámica de metilación de arginina en respuesta a una variedad de perturbaciones.
Este protocolo allana el camino para la caracterización del alcance y la dinámica de la metilación de proteínas en varios tipos de células y sistemas modelo que apoyan todos los aspectos de la investigación básica y traslacional centrada en los PRMT.
