이 프로토콜은 질량 분석법에 의한 단백질 아르기닌 메틸화의 글로벌 분석을 위한 최첨단 워크플로우를 나타내기 때문에 매우 중요합니다. 이것은 다른 생화학 기술로는 달성할 수 없는 단일 스타일 분해능으로 R-메틸화 단백질을 식별하고 프로파일링하는 유일한 방법입니다. 임상 시험 및 항암제에있는 PRMT 억제제의 사용과 함께이 프로토콜은 작용 메커니즘에 대한 심층 분석을 허용합니다.
시작하려면 최종 농도 4.5 밀리몰의 초순수에 용해 된 DTT 원액을 사용하여 단백질의 티올 그룹 환원을 수행하고 섭씨 55도에서 30 분 동안 반응을 진행하십시오. 10 밀리몰 농도의 요오도 아세트 아미드를 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 15 분 동안 배양하여 단백질의 티올 그룹의 알킬화를 수행하십시오. 단백질 분해 효율을 확인하려면 후속 분석을 위해 단백질 추출물의 분취량을 SDS-PAGE Coomassie 염색 젤에 저장하고 분해 시 해당 양의 샘플과 비교합니다.
나머지 단백질 추출물을 pH 8.0에서 4 부피의 20 밀리몰 헤페스로 희석하여 최종 요소 농도 2 몰에 도달합니다. 샘플을 두 부분으로 나눈 다음 시퀀싱 등급 변형 트립신을 하나에 추가하고 LysargiNase 프로테아제를 다른 부분에 추가합니다. 효소 분해를 위해 ThermoMixer에서 섭씨 37도에서 밤새 600회전으로 샘플을 그대로 두십시오.
각 크로마토그래피 그래디언트에 대해 모든 분획을 깊은 96웰 플레이트에 수집합니다. 그라디언트가 시작되기 전에 수집된 분수를 pre라는 이름의 단일 분수로 풀링합니다. 높은 pH 역상 액체 크로마토그래피 그래피에서 60개의 분획을 인접하지 않은 방식으로 풀링하여 14개의 최종 분획으로 연결합니다.
비연속 연결을 얻으려면 텍스트 원고에 설명된 대로 높은 pH 역상 분획을 풀링합니다. 그라디언트 후에 수집된 분수를 post라는 고유한 분수로 풀링합니다. 트립신 및 LysargiNase 소화로부터의 두 샘플에 대해 개별적으로 변형된 펩티드의 순차적 면역친화성 농축을 수행한다.
10X 농축된 면역친화성 정제 또는 IAP 완충액을 10배 희석한다. 동결건조된 펩티드를 2, 000 G에서 5분 동안 원심분리하여 펩티드를 튜브의 바닥으로 스핀다운시킨다. 15 밀리리터 튜브 당 250 마이크로 리터의 희석 된 IAP 버퍼로 펩타이드를 재현탁하고 1.5 밀리리터의 저 결합 튜브로 옮깁니다.
리트머스 종이를 사용하여 pH가 6보다 큰지 확인하십시오. 후속 MS 분석을 위한 입력으로 각 분획의 작은 부분 표본을 유지하십시오. 각 분획을 두 부분으로 분할하여 비대칭 디메틸화 또는 ADMA 및 대칭 디메틸화 또는 SDMA 펩타이드의 면역 농축을 병렬로 수행합니다.
초기 단백질 추출물 10 밀리그램 당 단백질 A 아가로스 비드에 접합된 선별된 항-팬 R 메틸화 항체의 3개 바이알을 준비한다. 각 바이알을 2, 000 G에서 30초 동안 원심분리하고 비드로부터 완충액을 제거하여 아가로스 비드에 접합된 정확한 양의 항체를 제조한다. 비드를 1X PBS 1 밀리리터로 2, 000 G에서 30 초 동안 원심 분리하여 3 회 세척하십시오.
마지막 세척 후 각 바이알에 대해 40마이크로리터 1X PBS에 비드를 재현탁하고 풀링한 다음 마지막으로 16개의 분획으로 균등하게 나눕니다. 각 튜브에 250마이크로리터의 1X IAP 버퍼를 추가하고 반전하여 혼합합니다. 그런 다음 회전하는 바퀴에서 튜브를 섭씨 4도에서 2 시간 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후, 펩티드 및 pan R-메틸 항체 접합 비드를 함유하는 1.5 밀리리터 튜브를 2, 000 G에서 30 초 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화하고 각 분획으로부터 유동을 깨끗한 1.5 밀리리터 저 결합 튜브로 옮긴다. R-모노메틸화에 대한 항체에 접합된 플로우스루에 비드를 추가하고 PBS에 재현탁을 반복하고, IAP 완충액으로 인큐베이션하고, 원심분리합니다. 펩타이드 샘플을 모노메틸화 또는 MMA 비드로 인큐베이션하는 동안, 이전에 항-ADMA 및 SDMA로 면역침전된 분획을 250마이크로리터 IAP 완충액으로 2회 세척하고 각 세척 후 상청액을 폐기합니다.
그런 다음 LC-MS 등급의 물로 세 번 씻으십시오. 각 튜브에 50마이크로리터의 0.15 TFA를 첨가하여 아가로스 비드로부터 친화성이 풍부한 SDMA 또는 ADMA 펩타이드를 용출시킵니다. 이 용액을 실온에서 10 분 동안 그대로두고 2-3 분마다 튜브를 뒤집습니다.
첫 번째 용출을 깨끗한 1.5 밀리리터 저 결합 튜브로 옮기고 50 마이크로 리터의 0.15 TFA로 용리를 반복합니다. 두 개의 용리 분획을 하나의 튜브에 모읍니다. 항-MMA 항체 비드와 함께 인큐베이션된 R-모노메틸화 펩티드에 대해 이 과정을 반복합니다.
가벼운 표지된 세포와 무거운 표지된 세포를 혼합한 후, 단백질을 추출하고 트립신 및 LysargiNase에 의해 소화시켰다. SDS-PAGE 쿠마시 염색 겔을 사용하여 펩타이드에서 총 단백질의 효율적인 효소 소화를 확인했습니다. C18 Sep-Pak 컬럼에 의해 수행된 정제 단계의 효율을 평가하여, C18 컬럼의 플로우스루와 1차 및 2차 세척에서 펩타이드의 부재와 용리액에 이들이 존재할 것으로 예상되는 것을 확인하였다.
무거운 채널에서 적절한 MET4 혼입 및 올바른 무겁거나 가벼운 혼합이 평가되었습니다. 펩타이드의 오프라인 고pH 역상 액체 크로마토그래피 분획과 분획의 후속 비연속 연결의 크로마토그램이 여기에 표시됩니다. 펩티드는 250 나노미터 UV에 의해 검출되었고, 잠재적으로 남아 있는 소화되지 않은 단백질은 280 나노미터 UV에 의해 평가되었다. 참양성 메틸 펩티드 주석을 나타내는 펩티드의 전체 MS 스펙트럼을 수득하였다.
3개의 피크 사이에서 관찰된 M 대 Z 차이는 효소적으로 메틸화된 잔기의 존재와 일치한다. 위양성 메틸 펩티드 주석을 나타내는 펩티드의 전체 MS 스펙트럼을 수득하였다. 가벼운 메틸화 펩타이드와 그의 징벌 적 무거운 대응 물 사이에서 관찰 된 M over Z 차이는 예상 값에서 0.0312만큼 벗어납니다.
프로토콜 워크플로는 전체적으로 선형이지만 특별한 주의가 필요한 몇 가지 단계가 있습니다. 예를 들어, 비연속 분획 연결을 사용한 IPH 크로마토그래피 분리 및 IP 설정. 동일한 프로토콜을 표준 SILAC 또는 무표지 정량화에 결합하여 다양한 섭동에 대한 반응으로 아르기닌 메틸화 역학을 프로파일링할 수 있습니다.
이 프로토콜은 PRMT에 초점을 맞춘 기초 및 중개 연구의 모든 측면을 지원하는 여러 세포 유형 및 모델 시스템에서 단백질 메틸화의 범위와 역학을 특성화하는 길을 열어줍니다.
