Bu protokol oldukça önemlidir, çünkü kütle spektrometrisi ile protein arginin metilasyonunun küresel analizi için en gelişmiş iş akışını temsil eder. Bu, R-metillenmiş proteini, diğer biyokimyasal tekniklerle elde edilemeyen tek bir stil çözünürlüğü ile tanımlamak ve profillemek için tek yöntemdir. Birçoğu klinik çalışmalarda ve anti-kanser ilaçlarında bulunan PRMT inhibitörlerinin kullanımı ile birleştiğinde, bu protokol etki mekanizmalarının derinlemesine analizine izin verir.
Başlamak için, ultra saf suda 4.5 milimolar nihai konsantrasyonda çözünmüş bir DTT stok çözeltisi kullanarak tiol protein grubunun indirgenmesini gerçekleştirin ve reaksiyonun 55 santigrat derecede 30 dakika boyunca gitmesine izin verin. 10 milimolar konsantrasyonda iyodoasetamid ekleyerek ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe ederek tiol protein grubunun alkilasyonunu gerçekleştirin. Proteoliz verimliliğini doğrulamak için, SDS-PAGE Coomassie boyalı jel üzerinde daha sonraki analizler için bir miktar protein ekstraktını saklayın ve sindirimden sonra karşılık gelen miktarda numune ile karşılaştırın.
İki azı dişinin nihai üre konsantrasyonuna ulaşmak için kalan protein ekstraktını pH 8.0'da dört hacim 20 milimolar HEPES ile seyreltin. Numuneyi iki parçaya bölün, ardından birine sıralama dereceli modifiye tripsin ve diğerine LysargiNase proteaz ekleyin. Enzimatik sindirime izin vermek için numuneleri gece boyunca bir ThermoMixer'da dakikada 600 dönüşte 37 santigrat derecede bırakın.
Her kromatografik gradyan için, tüm fraksiyonları derin bir 96 delikli plakada toplayın. Degradenin başlamasından önce toplanan fraksiyonları, pre adlı tek bir fraksiyonda toplayın. Yüksek pH ters fazlı sıvı kromatografik gradyandan 60 fraksiyonu, bitişik olmayan bir şekilde 14 son fraksiyonda toplayarak birleştirin.
Bitişik olmayan birleştirme elde etmek için, metin makalesinde açıklandığı gibi yüksek pH ters faz fraksiyonlarını bir araya getirin. Degradeden sonra toplanan kesirleri, post adlı benzersiz bir kesirde toplayın. Tripsin ve LysargiNase sindirimlerinden alınan iki örnek için modifiye peptidin sıralı immüno-afinite zenginleştirmesini ayrı ayrı gerçekleştirin.
10X konsantre immüno-afinite saflaştırmasını veya IAP tamponunu 10 kez seyreltin. Liyofilize peptitleri 2.000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve peptitleri tüpün dibine doğru döndürün. Peptitleri 15 mililitrelik tüp başına 250 mikrolitre seyreltilmiş IAP tamponu ile yeniden askıya alın ve 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın.
PH'ın altıdan büyük olduğunu kontrol etmek için bir turnusol kağıdı kullanın. Sonraki MS analizi için girdi olarak her fraksiyonun küçük bir aliquot'unu saklayın. Asimetrik olarak dimetillenmiş veya ADMA ve simetrik olarak dimetillenmiş veya SDMA peptitlerinin immüno-zenginleştirmesini paralel olarak gerçekleştirmek için her fraksiyonu iki parçaya bölün.
İlk protein ekstraktının 10 miligramı başına protein A agaroz boncuklarına konjuge edilmiş seçilmiş anti-pan R-metillenmiş antikorların üç şişesini hazırlayın. Her bir şişeyi 2.000 G'de 30 saniye boyunca santrifüj ederek ve tamponu boncuklardan çıkararak agaroz boncuklarına konjuge edilmiş doğru miktarda antikor hazırlayın. Boncukları 30 saniye boyunca 2.000 G'de santrifüj ederek bir mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, boncukları her şişe için 40 mikrolitre 1X PBS'de yeniden askıya alın, bir araya getirin ve son olarak 16 fraksiyona eşit olarak bölün. Her tüpe 250 mikrolitre 1X IAP tamponu ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Daha sonra tüpleri dönen bir tekerlek üzerinde iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, peptitler ve pan R-metil antikoru konjuge boncukları içeren 1.5 mililitrelik tüpleri, boncukları peletlemek ve akışı her fraksiyondan temiz bir 1.5 mililitrelik düşük bağlayıcı tüpe aktarmak için 30 saniye boyunca 2.000 G'de santrifüj edin. Boncukları, R-mono metilasyona karşı antikorlara konjuge edilmiş akışa ekleyin ve PBS'ye yeniden süspansiyonu, IAP tamponu ile inkübasyonu ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Peptit örneklerinin mono-metilizasyon veya MMA boncukları ile inkübasyonu sırasında, daha önce anti-ADMA ve SDMA ile immünoprestite edilmiş fraksiyonları 250 mikrolitre IAP tamponu ile iki kez yıkayın ve her yıkamadan sonra süpernatantı atın.
Daha sonra LC-MS sınıfı su ile üç kez yıkayın. Her tüpe 50 mikrolitre 0.15 TFA ekleyerek agaroz boncuklarından afinite zenginleştirilmiş SDMA veya ADMA peptitlerini salın. Bu çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, tüpleri her iki ila üç dakikada bir ters çevirin.
İlk elüsyonu temiz 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı tüplere aktarın ve elüsyonu 50 mikrolitre 0,15 TFA ile tekrarlayın. İki elüsyon fraksiyonunu tek bir tüpte toplayın. Anti-MMA antikor boncukları ile inkübe edilen R-mono-metillenmiş peptitler için bu işlemi tekrarlayın.
Hafif ve ağır etiketli hücreleri karıştırdıktan sonra, proteinler ekstrakte edildi ve tripsin ve LysargiNase tarafından sindirime tabi tutuldu. Peptitlerdeki toplam proteinlerin verimli enzimatik sindirimini doğrulamak için SDS-PAGE Coomassie boyalı bir jel kullanıldı. C18 Sep-Pak sütunu tarafından gerçekleştirilen saflaştırma adımının etkinliği değerlendirildi ve C18 kolonunun akışında ve birinci ve ikinci yıkamada peptidlerin bulunmadığı ve ayrıca elüentte beklenen mevcudiyetleri doğrulandı.
Ağır kanala uygun MET4 entegrasyonu ve doğru ağır veya hafif karışım değerlendirildi. Peptitlerin çevrimdışı yüksek pH'lı ters faz sıvı kromatografisi fraksiyonasyonundan elde edilen kromatogram ve ardından fraksiyonların bitişik olmayan birleşimi burada gösterilmiştir. Peptitler 250 nanometre UV ile tespit edilirken, potansiyel olarak sindirilmemiş proteinler 280 nanometre UV ile değerlendirildi. Gerçek pozitif metil peptid ek açıklamasını temsil eden peptidlerin tam MS spektrumları elde edildi.
Üç tepe noktası arasında gözlenen M üzerinden Z farklılıkları, enzimatik olarak metillenmiş kalıntının varlığı ile tutarlıdır. Yanlış pozitif metil peptid ek açıklamasını temsil eden peptidlerin tam MS spektrumları elde edildi. Hafif metillenmiş peptit ile cezalandırıcı ağır muadili arasında gözlenen M üzerinden Z farkları, beklenen değerden 0.0312 oranında sapmaktadır.
Protokol iş akışı genel olarak doğrusaldır, ancak özel dikkat gerektiren birkaç adım vardır. Örneğin, bitişik olmayan fraksiyon birleştirme ile IPH kromatografisi ayrımı ve IP kurulumu. Aynı protokol, çeşitli pertürbasyona yanıt olarak arginin metilasyon dinamiklerinin profilini çıkarmak için standart SILAC veya etiketsiz nicelemeye bağlanabilir.
Bu protokol, PRMT'lere odaklanan temel ve translasyonel araştırmaların tüm yönlerini destekleyen çeşitli hücre tiplerinde ve model sistemlerinde protein metilasyonunun kapsamının ve dinamiklerinin karakterizasyonuna yol açmaktadır.
