Ce protocole est très important car il représente le flux de travail de pointe pour l’analyse globale de la méthylation de protéines arginine par spectrométrie de masse. C’est la seule méthode pour identifier et profiler la protéine R-méthylée avec une résolution de style unique qui n’est pas réalisable avec d’autres techniques biochimiques. Associé à l’utilisation d’inhibiteurs de la PRMT, dont plusieurs font l’objet d’essais cliniques et de médicaments anticancéreux, ce protocole permet une analyse approfondie de leur mécanisme d’action.
Pour commencer, effectuez une réduction du groupe thiol des protéines à l’aide d’une solution mère de DTT dissous dans de l’eau ultrapure à une concentration finale de 4,5 millimolaires et laissez la réaction aller pendant 30 minutes à 55 degrés Celsius. Effectuer l’alkylation du groupe thiol des protéines en ajoutant de l’iodoacétamide à une concentration de 10 millimolaires et en incubant pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Pour vérifier l’efficacité de la protéolyse, conservez une partie aliquote de l’extrait de protéine pour une analyse ultérieure sur un gel coloré à la coomassie SDS-PAGE et comparez-le avec une quantité correspondante d’échantillon lors de la digestion.
Diluer l’extrait protéique restant avec quatre volumes de HEPES millimolaire à pH 8,0 pour atteindre une concentration finale d’urée de deux molaires. Divisez l’échantillon en deux parties, puis ajoutez la trypsine modifiée par séquençage à l’une et la protéase LysargiNase à l’autre. Laissez les échantillons pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un ThermoMixer à 600 rotations par minute pour permettre la digestion enzymatique.
Pour chaque gradient chromatographique, rassembler toutes les fractions dans une plaque profonde de 96 puits. Regroupez les fractions collectées avant le début du gradient en une seule fraction nommée pre. Concaténer les 60 fractions du gradient chromatographique liquide en phase inversée à pH élevé en les regroupant de manière non contiguë en 14 fractions finales.
Pour obtenir une concaténation non contiguë, mettez en commun les fractions de phase inversées à pH élevé décrites dans le manuscrit. Regroupez les fractions collectées après le gradient dans une fraction unique nommée post. Effectuer l’enrichissement séquentiel par immuno-affinité du peptide modifié séparément pour les deux échantillons issus des digestions trypsine et lysarginase.
Diluer 10X le tampon concentré de purification d’immunoaffinité ou IAP 10X. Centrifuger les peptides lyophilisés à 2 000 g pendant cinq minutes pour faire tourner les peptides vers le bas du tube. Remettez les peptides en suspension avec 250 microlitres de tampon IAP dilué par tube de 15 millilitres et transférez-les dans un tube à faible liaison de 1,5 millilitre.
Utilisez un papier de tournesol pour vérifier que le pH est supérieur à six. Conservez une petite partie aliquote de chaque fraction comme entrée pour l’analyse ultérieure de la SM. Diviser chaque fraction en deux parties pour effectuer l’enrichissement immunologique des peptides asymétriquement diméthylés, ou ADMA, et symétriquement diméthylés, ou SDMA, en parallèle.
Préparer trois flacons des anticorps anti-pan R-méthylés sélectionnés conjugués à des billes d’agarose de protéine A pour 10 milligrammes de l’extrait protéique initial. Préparer la bonne quantité d’anticorps conjugués aux billes d’agarose en centrifugeant chaque flacon à 2 000 g pendant 30 secondes et en retirant le tampon des billes. Lavez les billes trois fois avec un millilitre de 1X PBS en les centrifugeant à 2 000 G pendant 30 secondes.
Après le dernier lavage, remettez les billes en suspension dans 40 microlitres 1X PBS pour chaque flacon, regroupez-les puis divisez-les également en 16 fractions. Ajouter 250 microlitres de tampon IAP 1X à chaque tube et mélanger en le retournant. Ensuite, incuber les tubes sur une roue rotative pendant deux heures à quatre degrés Celsius.
Après l’incubation, centrifuger les tubes de 1,5 millilitre contenant des peptides et des billes conjuguées d’anticorps R-méthyl pan à 2 000 G pendant 30 secondes pour enduire les billes et transférer le flux de chaque fraction dans un tube propre de 1,5 millilitre à faible liaison. Ajouter les billes à l’écoulement conjuguées aux anticorps contre la R-monométhylation et répéter la remise en suspension dans le PBS, l’incubation avec le tampon IAP et la centrifugation. Pendant l’incubation des échantillons de peptides avec des billes de monométhylisation ou de MMA, laver deux fois les fractions précédemment immunoprécipitées avec de l’anti-ADMA et de la SDMA avec un tampon IAP de 250 microlitres et jeter le surnageant après chaque lavage.
Ensuite, lavez trois fois avec de l’eau de qualité LC-MS. Éluer les peptides SDMA ou ADMA enrichis par affinité des billes d’agarose en ajoutant 50 microlitres de 0,15 TFA à chaque tube. Laissez cette solution pendant 10 minutes à température ambiante, en retournant les tubes toutes les deux à trois minutes.
Transférer la première élution dans des tubes propres de 1,5 millilitre à faible liaison et répéter l’élution avec 50 microlitres de 0,15 TFA. Regrouper les deux fractions d’élution dans un seul tube. Répétez ce processus pour les peptides R-mono-méthylés qui ont été incubés avec les billes d’anticorps anti-MMA.
Après avoir mélangé les cellules marquées légères et lourdes, les protéines ont été extraites et soumises à la digestion par la trypsine et la lysarginase. Un gel coloré à la Coomassie SDS-PAGE a été utilisé pour vérifier l’efficacité de la digestion enzymatique des protéines totales dans les peptides. L’efficacité de l’étape de purification réalisée par la colonne C18 Sep-Pak a été évaluée, confirmant l’absence de peptides dans l’écoulement de la colonne C18 et dans le premier et le deuxième lavage ainsi que leur présence attendue dans l’éluant.
L’incorporation correcte de MET4 dans le canal lourd et le mélange lourd ou léger correct ont été évalués. Le chromatogramme du fractionnement par chromatographie liquide à pH élevé hors ligne en phase inversée des peptides et la concaténation non contiguë subséquente des fractions sont présentés ici. Les peptides ont été détectés par 250 nanomètres UV, tandis que les protéines potentiellement non digérées ont été évaluées par 280 nanomètres UV. Les spectres MS complets des peptides représentant une véritable annotation positive des peptides méthyliques ont été obtenus.
Les différences M sur Z observées entre les trois pics sont compatibles avec la présence de résidus méthylés enzymatiquement. Les spectres MS complets des peptides représentant une annotation de peptide méthylique faussement positive ont été obtenus. Les différences M sur Z observées entre le peptide méthylé léger et son homologue lourd punitif s’écartent de la valeur attendue de 0,0312.
Le flux de travail du protocole est globalement linéaire, mais certaines étapes nécessitent une attention particulière. Par exemple, la séparation par chromatographie IPH avec concaténation de fraction non contiguë, ainsi que la configuration IP. Le même protocole peut être couplé à la quantification standard SILAC ou sans marquage pour profiler la dynamique de méthylation de l’arginine en réponse à une variété de perturbations.
Ce protocole ouvre la voie à la caractérisation de l’étendue et de la dynamique de la méthylation des protéines dans plusieurs types cellulaires et systèmes modèles soutenant tous les aspects de la recherche fondamentale et translationnelle axée sur les PRMT.
