من أجل مراقبة بنية فائقة طبيعية رائعة من الخلايا، فمن الضروري لإصلاح الخلايا عن طريق التجميد السريع. تجميد شطيرة هي واحدة من أفضل الطرق لتجميد الخلايا دون تشكيل بلورات الجليد. يوضح هذا البروتوكول استخدام جهاز تجميد الساندويتشات ، ويصف أيضا إجراء صنع أقسام رقيقة جدا من العينات البديلة بالتجميد بعد تجميد السندويشات.
البدء في إعداد البروبان السائل عن طريق ملء حاوية النيتروجين السائل من جهاز تجميد شطيرة أو SFD مع النيتروجين السائل. ملء حاوية البروبان السائل مع البروبان السائل عن طريق إدخال غاز البروبان باستخدام فوهة غرامة. تسريع تماسك البروبان باستخدام شريط معدني مبرد.
لإعداد نوع مسطح وأقراص النحاس نوع السلة، وضعها على شريحة زجاجية مع عدم وجود جانب حرف حتى وعلاج مع توهج التفريغ في 10 باسكال، 400 فولت، ميلي أمبير واحد لمدة 30 ثانية لجعل سطح القرص hydrophilic باستخدام جهاز مراقب أيون. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي اثنين ملليلتر والطرد المركزي في 2, 900 مرات G لمدة 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant وتعليق بيليه للحصول على تعليق سميكة.
ضع كمية صغيرة أو حوالي 0.02 ميكرولتر من تعليق الخلية على قرص نحاسي. تغطية ذلك مع قرص نحاسي آخر والتقاط الأقراص مع ملاقط. جعل بئر في وسط البروبان الصلبة مع شريط معدني رقيقة.
تعيين ملاقط في SFD وتجميدها بسرعة عن طريق الضغط على زر الحقن للجهاز. نقع ملاقط المستخدمة في الماء درجة حرارة الغرفة لتسخينها لتجميد العينات التالية. استخدام الأنسجة الحيوانية والبشرية ثابتة في 2.5٪ غلوتارالدهيد، 0.1 ضرس الفوسفات العازلة من الحموضة 7.4.
شريحة لهم إلى 0.1 إلى 0.2 ملليمتر أقسام سميكة مع شفرة حلاقة تحت المجهر ستيريو. ضع قطرة صغيرة من محلول الجلوتارالدهيد على قرص النحاس من نوع السلة ، ثم استخدم الملاقط لوضع قطعة من الأنسجة في الجلوتارالدهيد على القرص النحاسي وتغطيتها بالقرص النحاسي المسطح. تجميد بسرعة الأقراص مع الأنسجة في البروبان ذوبان SFD كما هو موضح في وقت سابق.
نقل الأقراص إلى النيتروجين السائل في حمام العمل. باستخدام زوج من الملاقط المبردة في النيتروجين السائل، فصل الأقراص من بعضها البعض لفضح العينة. ضع الأقراص مع الخلايا في قارورة زجاجية مليئة ميليلتر واحد من الأسيتون يحتوي على 2٪ من التيتروكسيد أوسميوم التي تم وضعها في النيتروجين السائل وتماسكها.
نقل الأقراص إلى ثلاجة عميقة والاحتفاظ بها في ناقص 80 درجة مئوية لمدة يومين إلى أربعة أيام لتجميد استبدال الخلايا. جلب تدريجيا العينات إلى درجة حرارة الغرفة عن طريق احتضانها لمدة ساعتين في ناقص 20 درجة مئوية، ساعتين في أربع درجات مئوية، و 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل الأقراص إلى اثنين من أنابيب بلاستيكية ملليلتر التي تمتلئ ملليلتر واحد من الأسيتون.
إعداد راتنج الايبوكسي عن طريق خلط الكواشف في وعاء بلاستيكي يمكن التخلص منه باستخدام ستيرر. تبادل الأسيتون على التوالي مع 30٪ الراتنج في الأسيتون، 60٪ الراتنج و 90٪ الراتنج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة لكل منهما، ثم تبادل الراتنج 90٪ مع 100٪ الراتنج في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. وأخيرا، تضمين العينات في الراتنج 100٪في قالب تضمين السيليكون وبوليمرة لهم في 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
إخراج كتل البوليمرات من قوالب تضمين السيليكون وكتابة رقم العينة على الكتلة. إزالة أقراص النحاس من كتلة مع شفرة حلاقة وتقليم العينات جزءا لا يتجزأ من سطح الكتلة باستخدام شفرة التشذيب بالموجات فوق الصوتية وشفرات الحلاقة تحت المجهر ستيريو. بعد ذلك، تطبيق الشريط على تشاك كتلة العينة وحامل العينة من microtome وقطع الشريط عند الحدود.
إزالة كتلة من microtome فائقة، تعيينها في المجهر ستيريو، وتقليم كذلك إلى 0.2 ملليمتر في 0.3 ملليمتر باستخدام شفرة حلاقة. تطبيق النيوبرين على الشبكات لجعلها لاصقة. أعد ضبط الكتلة على الميكروتومي الفائق عن طريق محاذاة الأجزاء المسجلة.
تغطية microtome فائقة مع غطاء من البلاستيك وقطع 50 إلى 70 مقطعا سميكة نانومتر. استرداد المقاطع باستخدام حلقة. جبل لهم على 300 أو 400 شبكات النحاس شبكة تعامل مع النيوبرين وتجفيفها.
تعيين الشبكات مع أقسام في الأخدود من أنبوب سيليكون نصف. نقع العينات في محلول خلات أورانيل لمدة ثلاث دقائق. جمع محلول أورانيل المستخدمة وتخزينها في حقنة.
غسل العينات في أنبوب نصف مع طائرة المياه، ثم نقع العينات في سترات الرصاص لمدة ثلاث دقائق. بالنسبة لعينات الخميرة والفطريات ، ضع الشبكات على ورقة تصفية ، والتقطها بالملاقط ، وغطيها بفيلم النفثالين البلازمي على سطح الماء. أدخل الشبكات في حامل العينة من المجهر الإلكتروني ، ثم أدخل حامل العينة في المجهر الإلكتروني ولاحظ في 100 كيلوفولت.
وأظهرت أقسام رقيقة جدا من كل من الإشريكية القولونية وS.cerevisiae عندما لوحظ تحت المجهر الإلكتروني مورفولوجيا الطبيعية والصور واضحة. ولوحظت أقسام رقيقة جدا من الخلايا المستزرعة المجمدة بسرعة باستخدام SFD تحت المجهر الإلكتروني. كانت صور الأجزاء الرقيقة جدا من جلد الإنسان واضحة جدا وأظهرت مورفولوجيا طبيعية.
تم تجميد الجسيمات الأساسية لفيروس التهاب الكبد B بسرعة مع SFD ولاحظها المجهر الإلكتروني المبرد. أهم شيء هو أن نتذكر أنه يجب تطبيق كمية صغيرة جدا من الخلايا على أقراص النحاس بحيث يتم منع تشكيل الكريستال الجليد عند التجميد. من خلال إصلاح الأنسجة الحيوانية مع الجلوتارالدهيد مسبقا ، يتم تحقيق تجميد جيد على عمق حوالي 200 ميكرومتر على غرار العمق الذي تحققه تجميد الضغط العالي.
تمهد هذه التقنية الطريق للباحث لمراقبة البنية الطبيعية الرائعة للخلايا بسهولة بتكلفة منخفضة.
