על מנת להתבונן במבנה האולטרה הטבעי המעודן של תאים, יש צורך לתקן תאים על ידי הקפאה מהירה. הקפאת כריך היא אחת השיטות הטובות ביותר להקפאת תאים מבלי ליצור גבישי קרח. פרוטוקול זה מדגים את השימוש במכשיר הקפאת כריך, וגם מתאר את ההליך להכנת חלקים דקים במיוחד של דגימות שהוחלף בהקפאה לאחר הקפאת כריך.
התחל להכין פרופן נוזלי על ידי מילוי מיכל החנקן הנוזלי של מכשיר הקפאת הכריך או SFD עם חנקן נוזלי. מלא את מיכל פרופן נוזלי עם פרופן נוזלי על ידי החדרת גז פרופן באמצעות זרבובית עדינה. להאיץ את התגבשות פרופאן באמצעות מוט מתכת מקורר.
כדי להכין את הסוג השטוח ואת דיסקי נחושת סוג הסל, למקם אותם על שקופית זכוכית עם צד ללא אותיות למעלה ולטפל עם פריקה זוהרת ב 10 פסקל, 400 וולט, מיליאמפר אחד במשך 30 שניות כדי להפוך את משטח הדיסק הידרופילי באמצעות מנגנון תצפיתן יונים. העבר את ההשעיה התאית לצינור צנטריפוגה שני מיליליטר וצנטריפוגה ב 2, 900 פעמים G במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ולהשעות את הכדור כדי לקבל מתלה עבה.
מניח כמות קטנה או כ 0.02 microliters של השעיית התא על דיסק נחושת. לכסות אותו עם דיסק נחושת אחר ולאסוף את הדיסקים עם פינצטה. הפוך באר במרכז הפרופן המוצק עם מוט המתכת הדק.
הגדר את פינצטה ב- SFD והקפיא אותם במהירות על ידי לחיצה על כפתור ההזרקה של המנגנון. השרו את פינצטה משומשת במי טמפרטורת החדר כדי לחמם אותם להקפיא את הדגימות הבאות. השתמש ברקמות בעלי חיים ובני אדם קבוע ב 2.5%glutaraldehyde, 0.1 חוצץ פוספט טחון של pH 7.4.
פורסים אותם לחלקים בעובי 0.1 עד 0.2 מילימטר עם סכין גילוח מתחת למיקרוסקופ סטריאו. מניחים טיפה קטנה של תמיסת glutaraldehyde על דיסק נחושת סוג הסל, ולאחר מכן להשתמש פינצטה למקם חתיכת רקמה glutaraldehyde על דיסק נחושת לכסות אותו עם דיסק נחושת שטוח. להקפיא במהירות את הדיסקים עם הרקמות בפרופאן ההיתוך של SFD כפי שהודגם קודם לכן.
מעבירים את הדיסקים לחנקן נוזלי באמבט עובד. בעזרת פינצטה מקוררת בחנקן נוזלי, נתק את הדיסקים זה מזה כדי לחשוף את הדגימה. מניחים את הדיסקים עם התאים ב בקבוקון זכוכית כי הוא מלא מיליליטר אחד של אצטון המכיל 2%osmium tetroxide כי כבר ממוקם חנקן נוזלי מוצק.
מעבירים את הדיסקים למקפיא עמוק ושומרים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך יומיים עד ארבעה ימים להקפאת החלפת התאים. בהדרגה להביא את הדגימות לטמפרטורת החדר על ידי דגירה אותם במשך שעתיים במינוס 20 מעלות צלזיוס, שעתיים בארבע מעלות צלזיוס, ו 15 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את הדיסקים לשני צינורות פלסטיק מיליליטר כי הם מלאים מיליליטר אחד של אצטון.
הכן שרף אפוקסי על ידי ערבוב ריאגנטים במיכל פלסטיק חד פעמי באמצעות מערבל. החליפו את האצטון ברציפות עם 30% שרף באצטון, 60% שרף ו-90% שרף בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כל אחד, ואז החליפו את השרף 90% עם 100% שרף ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. לבסוף, הטמע את הדגימות ב 100% שרף בתבנית הטמעת סיליקון ופולימר אותם ב 60 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
מוציאים את הבלוקים הפולימריים מתבניות הסיליקון ומכתבים את מספר הדגימה בבלוק. הסר את דיסקי הנחושת מהבלוק עם סכין גילוח ולחתוך את הדגימות מוטבע על פני השטח בלוק באמצעות להב חיתוך קולי וסכיני גילוח תחת מיקרוסקופ סטריאו. לאחר מכן, החל סרט הדבקה על צ'אק בלוק הדגימה ומחזיק הדגימה של המיקרוטום וחתכו את הקלטת בגבול.
הסר את הבלוק מן המיקרוטום אולטרה, להגדיר אותו במיקרוסקופ סטריאו, לקצץ אותו עוד יותר ל 0.2 מילימטרים על 0.3 מילימטרים באמצעות סכין גילוח. החל neoprene על הרשתות כדי להפוך אותם דבק. הגדר את הבלוק בחזרה למיקרוטומיה האולטרה על-ידי יישור החלקים המודבקים.
לכסות את המיקרוטומיה האולטרה עם כיסוי פלסטיק לחתוך 50 עד 70 ננומטר קטעים בעובי. אחזר את המקטעים באמצעות לולאה. הר אותם על 300 או 400 רשתות נחושת רשת שטופלו neoprene ולייבש אותם.
הגדר את הרשתות עם מקטעים בחריץ של צינור חצי סיליקון. משרים את הדגימות בתמיסת אצטט אורניל במשך שלוש דקות. לאסוף את פתרון אורניל בשימוש ולאחסן אותו במזרק.
לשטוף את הדגימות בחצי צינור עם סילון מים, ולאחר מכן להשרות את הדגימות ציטוט עופרת במשך שלוש דקות. עבור שמרים ודגימות פטרייתיות, מניחים את הרשתות על נייר מסנן, להרים אותם עם פינצטה, ולכסות אותם עם סרט נפטלין פלזמה פולימר על פני המים. הכנס את הרשתות למחזיק הדגימה של מיקרוסקופ אלקטרונים, ולאחר מכן הכנס את מחזיק הדגימה למיקרוסקופ האלקטרונים והתבונן ב-100 קילו-וולט.
חלקים דקים במיוחד של E.coli ו- S.cerevisiae כאשר נצפו תחת מיקרוסקופ האלקטרונים הראו מורפולוגיה טבעית ותמונות ברורות. חלקים דקים במיוחד של תאים בתרבית שהוקפאו במהירות באמצעות SFD נצפו תחת מיקרוסקופ האלקטרונים. התמונות של חלקים דקים במיוחד של העור האנושי היו ברורות מאוד והראו מורפולוגיה טבעית.
חלקיקי הליבה של וירוס הפטיטיס B הוקפאו במהירות עם SFD ונצפתו על ידי מיקרוסקופיה אלקטרונית קריו. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא שאתה צריך להחיל כמות קטנה מאוד של תאים על דיסקי נחושת, כך היווצרות גביש קרח נמנע על הקפאה. על ידי תיקון רקמות בעלי חיים עם glutaraldehyde מראש, הקפאה טובה בעומק של כ -200 מיקרומטר מושגת בדומה לעומק שהושג על ידי הקפאה בלחץ גבוה.
טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקר להתבונן במבנה האולטרה הטבעי המעודן של תאים בקלות בעלות נמוכה.
