Hücrelerin enfes doğal ultra yapısını gözlemlemek için, hücreleri hızlı dondurarak sabitlemek gerekir. Sandviç dondurma, buz kristalleri oluşturmadan hücreleri dondurmak için en iyi yöntemlerden biridir. Bu protokol sandviç dondurma cihazının kullanımını gösterir ve ayrıca sandviç dondurma işleminden sonra dondurarak ikame edilen numunelerin ultra ince bölümlerinin yapılması prosedürünü açıklar.
Sandviç dondurma cihazının veya SFD'nin sıvı azot kabını sıvı nitrojenle doldurarak sıvı propan hazırlamaya başlayın. İnce bir nozül kullanarak propan gazı sokarak sıvı propan kabını sıvı propanla doldurun. Soğutulmuş bir metal çubuk kullanarak propan katılaşmasını hızlandırın.
Düz tip ve sepet tipi bakır diskleri hazırlamak için, harfsiz tarafı yukarı olacak şekilde bir cam kaydırağa yerleştirin ve diski bir iyon gözcü aparatı kullanarak hidrofilik hale getirmek için 30 saniye boyunca 10 pascals, 400 volt, bir miliamperde kızdırma deşarjı ile muamele edin. Hücre süspansiyonu oda sıcaklığında 10 saniye boyunca 2.900 kez G'de iki mililitre santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın. Kalın bir süspansiyon elde etmek için süpernatant çıkarın ve peletin askıya alın.
Bakır bir diske az miktarda veya yaklaşık 0,02 mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirin. Üzerini başka bir bakır diskle örtün ve diskleri cımbızla alın. İnce metal çubukla katı propanın ortasına bir kuyu yapın.
Cımbızı bir SFD'ye ayarlayın ve cihazın enjeksiyon düğmesine basarak hızla dondurun. Kullanılan cımbızları oda sıcaklığındaki suda bekleterek aşağıdaki örnekleri dondurmak için ısıtın. %2,5 glutaraldehit, 0,1 molar fosfat tamponu pH 7,4'e sabitlenmiş hayvan ve insan dokularını kullanın.
Stereo mikroskop altında jiletle 0,1 ila 0,2 milimetre kalınlığında bölümler halinde dilimleyin. Glutaraldehit çözeltisinin küçük bir damlasını sepet tipi bakır diske yerleştirin, ardından cımbız kullanarak bakır diskteki glutaraldehitin içine bir parça doku yerleştirin ve düz bakır diskle örtün. Diskleri daha önce gösterildiği gibi SFD'nin eriyen propanındaki dokularla hızla dondurun.
Diskleri çalışan bir banyoda sıvı nitrojene aktarın. Sıvı nitrojenle soğutulmuş bir çift cımbız kullanarak, numuneyi açığa çıkarmak için diskleri birbirinden ayırın. Hücrelerin bulunduğu diskleri, sıvı nitrojene yerleştirilmiş ve katılaşmış%2 osmiyum tetroksit içeren bir mililitre asetonla doldurulmuş bir cam şişeye yerleştirin.
Diskleri derin bir dondurucuya aktarın ve hücrelerin dondurulması için iki ila dört gün boyunca eksi 80 santigrat derecede tutun. Örnekleri yavaş yavaş eksi 20 santigrat derecede iki saat, dört santigrat derecede iki saat ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırarak oda sıcaklığına getirin. Diskleri bir mililitre asetonla doldurulmuş iki mililitre plastik boruya aktarın.
Reaktifleri bir karıştırıcı kullanarak tek kullanımlık plastik bir kapta karıştırarak epoksi reçinesi hazırlayın. Asetonda% 30 reçine, her biri bir saat oda sıcaklığında% 60 reçine ve% 90 reçine ile art arda değiştirin, ardından% 90 reçineyi bir gecede 37 santigrat derecede% 100 reçine ile değiştirin. Son olarak, numuneleri silikon gömme kalıbına% 100 reçineye gömün ve 24 saat boyunca 60 santigrat derecede polimerize edin.
Polimerize blokları silikon gömme kalıplarından çıkar ve numune numarasını bloğa yazın. Bakır diskleri bir jiletle bloktan çıkarın ve stereo mikroskop altında ultrasonik bir kesme bıçağı ve jilet kullanarak blok yüzeye gömülü örnekleri kesin. Daha sonra, numune bloğu aynasına ve mikrotom numune tutucusuna bant uygulayın ve bandı sınırda kesin.
Bloğu ultra mikrotomdan çıkarın, stereo mikroskopla ayarlayın ve jilet kullanarak 0,3 milimetreye 0,2 milimetreye kadar kesin. Yapışkan hale getirmek için ızgaralara neopren uygulayın. Bantlanmış parçaları hizalayarak bloğu ultra mikrotom üzerinde geri ayarlayın.
Ultra mikrotomları plastik bir kapakla örtün ve 50 ila 70 nanometre kalınlığında bölümler kesin. Döngü kullanarak bölümleri alın. Neopilen ile muamele edilmiş 300 veya 400 örgü bakır ızgaraya monte edin ve kurutun.
Izgaraları yarım silikon tüpün oluğunda bölümleri olan şekilde ayarlayın. Örnekleri üç dakika boyunca uranil asetat çözeltisinde bekletin. Kullanılmış uranil çözeltisini toplayın ve bir şırınnada saklayın.
Numuneleri yarım tüpte bir su jeti ile yıkayın, ardından numuneleri üç dakika boyunca kurşun sitratta bekletin. Maya ve mantar örnekleri için ızgaraları bir filtre kağıdına yerleştirin, cımbızla alın ve su yüzeyinde plazma polimerize naftalin filmi ile örtün. Izgaraları bir elektron mikroskobun numune tutucusuna yerleştirin, ardından numune tutucuyu elektron mikroskobuna yerleştirin ve 100 kilovoltta gözlemleyin.
Elektron mikroskobu altında gözlendiğinde hem E.coli hem de S.cerevisiae'nin ultra ince bölümleri doğal morfoloji ve net görüntüler gösterdi. Elektron mikroskobu altında SFD kullanılarak hızla dondurulan kültürlü hücrelerin ultra ince bölümleri gözlendi. İnsan derisinin ultra ince bölümlerinin görüntüleri çok açıktı ve doğal morfoloji gösterdi.
Hepatit B virüs çekirdek parçacıkları SFD ile hızla donduruldu ve kriyo elektron mikroskopisi ile gözlemlendi. Unutulmaması gereken en önemli şey, bakır disklere çok az miktarda hücre uygulamanız gerektiğidir, böylece donma sırasında buz kristali oluşumunun önüne geçilir. Hayvan dokularını önceden glutaraldehit ile sabitlenerek, yüksek basınçlı dondurma ile elde edilen derinliğe benzer şekilde yaklaşık 200 mikrometre derinlikte iyi donma elde edilir.
Bu teknik, bir araştırmacının hücrelerin enfes doğal ultra yapısını düşük maliyetle kolayca gözlemlemesinin önünü açıyor.
