세포의 절묘한 자연 울트라 구조를 관찰하기 위해서는 신속한 동결에 의해 세포를 고칠 필요가 있다. 샌드위치 동결은 얼음 결정을 형성하지 않고 세포를 동결하기위한 가장 좋은 방법 중 하나입니다. 이 프로토콜은 샌드위치 동결 장치의 사용을 보여 주며 샌드위치 동결 후 동결 대체 된 표본의 초박형 섹션을 만드는 절차를 설명합니다.
샌드위치 동결 장치 또는 SFD의 액체 질소 용기를 액체 질소로 채우면 액체 프로판 을 준비하기 시작합니다. 미세노즐을 사용하여 프로판 가스를 도입하여 액체 프로판 용기를 액체 프로판으로 채웁니다. 냉각된 금속 막대를 사용하여 프로판의 응고를 가속화합니다.
플랫 타입과 바구니 형 구리 디스크를 준비하려면, 글자 면이 없는 유리 슬라이드에 놓고 10 개의 파스칼, 400 볼트, 1 밀리암페어에서 30 초 동안 1 밀리암페어로 치료하여 이온 스포터 장치를 사용하여 디스크 표면 친수성 으로 처리하십시오. 셀 서스펜션을 실온에서 10초 동안 2밀리리터 원심분리기 튜브와 원심분리기로 2, 900회 G로 옮긴다. 상체를 제거하고 두꺼운 서스펜션을 얻기 위해 펠릿을 중단합니다.
구리 디스크에 소량 또는 약 0.02 마이크로리터를 배치합니다. 다른 구리 디스크로 덮고 핀셋으로 디스크를 선택합니다. 얇은 금속 막대로 단단한 프로판 의 중앙에 잘 만듭니다.
핀셋을 SFD에 설정하고 장치의 사출 버튼을 눌러 신속하게 동결하십시오. 사용 된 핀셋을 실온 물에 담그고 다음 표본을 얼러 뜨십시오. pH 7.4의 2.5%의 글루타랄데히드, 0.1 어금반 인산완충액으로 고정된 동물 및 인간 조직을 사용한다.
스테레오 현미경 아래 면도날로 0.1 ~ 0.2 밀리미터 두께의 섹션으로 슬라이스합니다. 바구니 형 구리 디스크에 글루타랄데히드 용액의 작은 방울을 놓고 핀셋을 사용하여 구리 디스크의 글루타랄데히드에 조직의 조각을 놓고 평평한 구리 디스크로 덮습니다. SFD의 용융 프로판에서 조직으로 디스크를 빠르게 동결하여 앞에서 설명했습니다.
디스크를 작업 용 욕조에서 액체 질소로 옮기. 액체 질소에서 냉각된 핀셋 한 쌍을 사용하여 디스크를 분리하여 시편을 노출합니다. 액체 질소에 배치되고 고화된 2%osmium 테트산화물을 포함하는 아세톤의 1 밀리리터로 채워진 유리 유리병에 세포를 놓습니다.
디스크를 깊은 냉동고로 옮기고 세포의 동결 대체를 위해 2 ~4 일 동안 영하 80도에서 보관하십시오. 점차적으로 영하 20도에서 2 시간, 섭씨 4도에서 2 시간, 실온에서 15 분 동안 배양하여 표본을 실온으로 가져옵니다. 디스크를 아세톤의 1밀리리터로 채워진 2밀리리터 플라스틱 튜브로 옮습니다.
교반자를 사용하여 일회용 플라스틱 용기에 시약을 혼합하여 에폭시 수지준비합니다. 아세톤에 30%의 수지, 실온에서 각각 60%, 수지 90%로 아세톤을 연속적으로 교환한 다음, 90%수지와 100%수지100%를 하룻밤 사이에 섭씨 37도로 교환합니다. 마지막으로, 실리콘 엠베딩 몰드에 100% 수지에 샘플을 포함하고 24시간 동안 섭씨 60도에서 중합합니다.
실리콘 포함 금형에서 중합 된 블록을 꺼내 블록에 표본 번호를 작성합니다. 면도날로 블록에서 구리 디스크를 제거하고 스테레오 현미경으로 초음파 트리밍 블레이드와 면도날을 사용하여 블록 표면에 내장 된 표본을 다듬습니다. 다음으로, 시편 블록 척과 마이크로톤의 표본 홀더에 테이프를 적용하고 경계에서 테이프를 잘라낸다.
초미세토메에서 블록을 제거하고 스테레오 현미경으로 설정하고 면도날을 사용하여 0.2 밀리미터로 더 다듬습니다. 그리드에 네오프렌을 적용하여 접착제를 만듭니다. 녹화된 부품을 정렬하여 울트라 마이크로톤에 블록을 다시 설정합니다.
플라스틱 커버로 울트라 마이크로토메를 덮고 50~70나노미터 두께의 단면을 잘라냅니다. 루프를 사용하여 섹션을 검색합니다. 네오프렌으로 처리 300 또는 400 메쉬 구리 그리드에 마운트하고 건조.
반 실리콘 튜브의 홈에 섹션으로 그리드를 설정합니다. 시편을 우라일 아세테이트 용액에 3분간 담급니다. 사용된 우라일 용액을 수집하고 주사기에 보관하십시오.
시편을 워터 제트로 반 튜브로 씻은 다음 시편을 납 구연산에 담급3분간 담급니다. 효모 및 곰팡이 표본의 경우, 필터 용지에 그리드를 놓고 핀셋으로 집어 들고 수면에 플라즈마 중합 된 냅탈렌 필름으로 덮습니다. 전자 현미경의 표본 홀더에 그리드를 삽입한 다음 표본 홀더를 전자 현미경에 삽입하고 100 킬로볼트에서 관찰하십시오.
전자 현미경으로 관찰될 때 E.coli와 S.cerevisiae의 초박형 섹션은 자연적인 형태와 명확한 심상을 보여주었습니다. SFD를 사용하여 급속하게 동결된 배양 세포의 초박형 단면은 전자 현미경하에서 관찰되었다. 인간의 피부의 초박형 부분의 이미지는 매우 명확하고 자연적인 형태를 보였다.
B형 간염 바이러스 코어 입자는 SFD로 급속히 동결되었고 극저온 전자 현미경 검사법에 의해 관찰되었다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 얼음 결정 형성이 동결 시 방지되도록 구리 디스크에 매우 적은 양의 세포를 적용해야 한다는 것입니다. 조미료알데히드로 동물 조직을 미리 고정함으로써 약 200 마이크로미터 깊이에서 좋은 동결을 달성하면 고압 동결에 의해 달성된 깊이와 유사하게 달성된다.
이 기술은 연구원이 저렴한 비용으로 쉽게 세포의 절묘한 자연 울트라 구조를 관찰 할 수있는 길을 열어줍니다.
