Для того чтобы наблюдать изысканную естественную ультраструктуру клеток, необходимо зафиксировать клетки путем быстрого замораживания. Сэндвич-замораживание является одним из лучших методов замораживания клеток без образования кристаллов льда. Данный протокол демонстрирует использование сэндвич-морозильного устройства, а также описывает процедуру изготовления ультратонких срезов замороженных образцов после сэндвич-замораживания.
Начните приготовление жидкого пропана, заполнив контейнер с жидким азотом сэндвич-морозильного устройства или SFD жидким азотом. Заполните контейнер с жидким пропаном жидким пропаном, введя газ пропан с помощью тонкой насадки. Ускорьте затвердевание пропана с помощью охлаждаемого металлического стержня.
Чтобы подготовить медные диски плоского и корзинчатого типа, поместите их на стеклянную горку без буквы стороной вверх и обработайте тлеющим разрядом при 10 паскалях, 400 вольт, одной миллиампере в течение 30 секунд, чтобы сделать поверхность диска гидрофильной с помощью аппарата ионного споттера. Перенесите клеточную суспензию в двухмиллилитровую центрифужную трубку и центрифугу при 2 900 G в течение 10 секунд при комнатной температуре. Удалите супернатант и суспендируйте гранулу до получения густой суспензии.
Поместите небольшое количество или приблизительно 0,02 микролитра клеточной суспензии на медный диск. Накройте его другим медным диском и подберите диски пинцетом. Сделайте лунку в центре из твердого пропана с тонким металлическим стержнем.
Установите пинцет в SFD и быстро заморозьте их, нажав кнопку впрыска аппарата. Замочите использованный пинцет в воде комнатной температуры, чтобы согреть их, чтобы заморозить следующие образцы. Используют ткани животных и человека, закрепленные в 2,5% глутаральдегида, 0,1 молярного фосфатного буфера рН 7,4.
Нарежьте их на участки толщиной от 0,1 до 0,2 миллиметра лезвием бритвы под стереомикроскопом. Поместите небольшую каплю раствора глутаральдегида на медный диск корзинчатого типа, затем с помощью пинцета поместите кусочек ткани в глутаровый альдегид на медный диск и накройте его плоским медным диском. Быстро замораживает диски с тканями в плавящемся пропане SFD, как показано ранее.
Переведите диски в жидкий азот в рабочей ванне. Используя пару пинцетов, охлажденных жидким азотом, отделите диски друг от друга, чтобы обнажить образец. Поместите диски с клетками в стеклянный флакон, который заполнен одним миллилитром ацетона, содержащим 2% тетроксида осмия, который был помещен в жидкий азот и затвердел.
Переложите диски в глубокую морозильную камеру и держите их при минус 80 градусах Цельсия в течение двух-четырех дней для замораживания ячеек. Постепенно доведите экземпляры до комнатной температуры, высиживая их в течение двух часов при минус 20 градусах Цельсия, двух часов при четырех градусах Цельсия и 15 минут при комнатной температуре. Переложите диски на две миллилитровые пластиковые трубки, которые заполнены одним миллилитром ацетона.
Приготовьте эпоксидную смолу, смешав реагенты в одноразовом пластиковом контейнере с помощью мешалки. Замените ацетон последовательно 30% смолой в ацетоне, 60% смолой и 90% смолой при комнатной температуре в течение одного часа каждый, затем замените 90% смолу на 100% смолу при 37 градусах Цельсия в течение ночи. Наконец, вставьте образцы в 100% смолу в силиконовую форму для встраивания и полимеризуйте их при 60 градусах Цельсия в течение 24 часов.
Выньте полимеризованные блоки из силиконовых форм для встраивания и напишите номер образца на блоке. Извлеките медные диски из блока лезвием бритвы и обрежьте образцы, встроенные в поверхность блока, с помощью ультразвукового лезвия для обрезки и лезвий бритвы под стереомикроскопом. Далее накладываем ленту на образец блока патрона и образец держателя микротома и разрезаем ленту на границе.
Извлеките блок из ультрамикротома, установите его в стереомикроскоп и обрежьте его далее до 0,2 миллиметра на 0,3 миллиметра с помощью лезвия бритвы. Нанесите неопрен на сетки, чтобы сделать их клейкими. Установите блок обратно на ультрамикротом, выровняв заклеенные детали.
Накройте ультрамикротом пластиковой крышкой и вырежьте участки толщиной от 50 до 70 нанометров. Извлеките разделы с помощью цикла. Установите их на 300 или 400 сетчатых медных сетках, обработанных неопреном, и высушите их.
Установите сетки с секциями в паз полусилиновой трубки. Замочите образцы в растворе уранилацетата в течение трех минут. Соберите использованный раствор уранила и храните его в шприце.
Промыть образцы в полутрубке струей воды, затем замочить образцы в цитрате свинца в течение трех минут. Для дрожжевых и грибковых образцов поместите сетки на фильтровальную бумагу, подберите их пинцетом и накройте плазменной полимеризованной нафталиновой пленкой на поверхности воды. Вставьте сетки в держатель образца электронного микроскопа, затем вставьте держатель образца в электронный микроскоп и наблюдайте при 100 киловольтах.
Ультратонкие срезы как E.coli, так и S.cerevisiae при наблюдении под электронным микроскопом показали естественную морфологию и четкие изображения. Ультратонкие участки культивируемых клеток, быстро замороженных с использованием SFD, наблюдались под электронным микроскопом. Изображения ультратонких участков кожи человека были очень четкими и показывали естественную морфологию.
Частицы ядра вируса гепатита В быстро замораживали с помощью SFD и наблюдали с помощью криоэлектронной микроскопии. Самое главное, что нужно помнить, это то, что вы должны наносить очень небольшое количество клеток на медные диски, чтобы предотвратить образование кристаллов льда при замерзании. Зафиксировав ткани животных глутаровым альдегидом заранее, достигается хорошая промерзание на глубине около 200 микрометров, аналогичное глубине, достигаемой замораживанием под высоким давлением.
Этот метод прокладывает путь для исследователя, чтобы наблюдать изысканную естественную ультраструктуру клеток легко при низких затратах.
