يوفر هذا البروتوكول سعة عالية وتركيبة موثوقة لتحليل NHEJ التي يمكن أن تحدد انتشار وكمية نسبية من طفرات Indel في مجموعات البعوض المحررة جينيا. بالمقارنة مع الجيل القادم، أو تسلسل سانجر، ddPCR لديه وقت تحول أسرع للنتائج، والذي يسمح بتحليل سريع وكامل للتنوع الجيني لحقل للكائنات المعدلة وراثيا. وينبغي أن تنطبق هذه الطريقة عموما على جميع النظم التجريبية.
وسوف يكون إثبات الإجراء التايلاندي فام، وهو باحث مشارك من مختبر يانغ. في البداية، قم بإعداد 25 ميكرولتر من ثنائي الفينيل متعدد الكلور الرقمي، أو مزيج عينة ddPCR عن طريق إضافة مزيج سوبر ddPCR، والتمهيدات الأمامية والعكسية، ومسابير HEX أو FAM، والحمض النووي والماء بالنسب الموصوفة في النص. ثم تخلط تماما رد الفعل عن طريق الدوامة.
باستخدام ماصة متعددة القنوات 50 ميكرولتر، قم بتحميل 20 ميكرولتر من مزيج عينات ddPCR في الصف الأوسط من الخرطوشة. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات 200 ميكرولتر لتحميل 70 ميكرولتر من الزيت في الصف السفلي دون توليد فقاعات في جميع أنحاء ماصة. ضع طوقا، لمس الحواف فقط، وتجنب المركز، منطقة مقعرة، ومن ثم وضع لوحة بشكل آمن في مولد قطرة، وإغلاق الغطاء لبدء تشغيل.
لنقل مزيج الغمر من الصف العلوي من الخرطوشة إلى لوحة 96 بئرا، استخدم ماصة متعددة القنوات، وأسقط 40 ميكرولتر من العينة السائلة لمدة ثلاث إلى خمس ثوان بزاوية تتراوح بين 30 و45 درجة. ثم طرد الخليط في البئر ببطء لأكثر من ثلاث ثوان بزاوية 45 درجة، مما يسمح لها بالانسدل من الجانب، ومن ثم انتقل إلى المحطة الثانية من المصصة لطرد السائل تماما. باستخدام الأختام الحرارة احباط، ختم لوحات لمدة خمس ثوان في 180 درجة مئوية.
ضع اللوحة المغلقة في دراجة حرارية، وحدد شروط PCR لإرشادات إسقاط NHEJ عن طريق تعيين التشبع الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، تعيين 40 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ل denature، 55 درجة مئوية من دقيقة واحدة إلى آنال، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقتين لتمديد. بعد 40 دورة، تعيين عقد في 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وعقد النهائي في أربع درجات مئوية.
استخدم معدل منحدر درجتين مئويتين في الثانية لكل الخطوات. سوف تختلف درجة حرارة التلين، وفقا للمسابير أو التمهيدي المستخدمة. ضع اللوحة بشكل آمن في قارئ القطرات مع A1 المسمى جيدا في أعلى اليسار.
افتح البرنامج و قم بإعداد اللوحة عن طريق تعيين FAM كقناة مرجعية معروفة، و HEX كالقناة المجهولة لكل بئر. ثم قم بتغيير الاسم لكل عينة. تشغيل تجربة قراءة القطيرات كمكم مباشر أثناء حفظ القالب.
تعيين المعلمات التجريبية الصحيحة لتحليل البرامج ، وهي عينة من المعلومات ، والمزيج الفائق ، واسم الهدف ، ونوع الهدف ، وقناة الإشارة الأولى والقناة الثانية. ثم، تعيين عتبة لعدد قطرات فوق 10،000 للحصول على نتائج موثوق بها. بعد ذلك ، تحقق من عدد القطرات لكل بئر في علامة التبويب القطيرات ، مما يضمن أن جميعها فوق 10،000.
وأخيرا، تحقق من السعة 1D لفصل الإشارات الفعال عن السلبيات. في محرر اللوحة، قم بتمييز اللوحة بأكملها، ثم قم بتعيين نوع التجربة للإنزال. تعيين هدف WT كمرجع، تعيين القناة الأولى ل FAM والقناة الثانية ل HEX.
تعيين NHEJ الهدف كما غير معروف، تعيين القناة الأولى لFAM والقناة الثانية كما لا شيء. في علامة التبويب السعة 2D، تعيين عتبات الكتلة باستخدام أدوات الرسم البياني لكل عينة. ويرتبط الذيل عادة مع الكتلة WT لNHEJ المقايسات.
تحت علامة التبويب نسبة، انقر على رمز العتاد من أعلى يمين الرسم البياني، وحدد وفرة كسور لرسم نقطة المقابلة للنسبة المئوية للأحداث NHEJ. 15 عينات مختلفة سحبت من 10 البعوض كل تحتوي على مختلف الأليل NHEJ، تم تحليلها وتحديدها باستخدام المقايسة قطرة، وأظهرت النتائج أن جميع العينات 15 حملت 100٪ Indel أليليس. وفي تجربة أخرى، تم فحص 11 عينة من البعوض البري وبعوض NHEJ بنسب مئوية مختلفة من NHEJ مع بروتوكول ddPCR هذا.
وأظهرت النتائج أن النسبة المئوية المحددة كانت قريبة نسبيا من الكشف عن Indel عن طريق تقنية تحليل amplicon. ماصة ببطء لتجنب الفقاعات، والسماح لجميع قطرات مستحلب بالتنقيط أسفل جدار الآبار.
