نشكر الدكاترة. أنتوني كورنيل ولورا نوريس في جامعة كاليفورنيا في ديفيس والدكتور كاتارينا Kreppel في جامعة غلاسكو لتوفير عينات البعوض من تنزانيا. نشكر السيدة سميتا داس والدكتور دوغلاس نوريس من مدرسة جونز هوبكنز للصحة العامة لتبادل عينات البعوض من زامبيا. كما نشكر السيد لي V. ميون في مختبر علم الوراثة البيطرية للتدريب على تصميم الفحص. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01AI 078183 وR21AI062929.

1. PCR التضخيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط جميع الاشعال PCR (انظر الجدول تكميلية S1) في microtube 1.5ml. كل SNP اثنين الاشعال (إلى الأمام وعكس). تأكد من أن تركيز الأسهم من كل التمهيدي PCR يتم الاحتفاظ بمبلغ 100 ميكرومتر. تقديم ما يكفي من مزيج التمهيدي ل500-1،000 ردود الفعل للحد من pipetting لخطأ والوقت على مقاعد البدلاء (انظر الجدول التكميلي S2). إذا رغبت في ذلك، وإعداد مأخوذة عن 100-200 ردود الفعل في أنبوب وتخزينها في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PCR الكوكتيل كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة (الجدول 1). ويشمل حجم ردود الفعل لمدة 96 فائض من 20٪. دوامة الأنبوب الذي يحتوي على كوكتيل PCR بخفة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 2،000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 3 ميكرولتر من الكوكتيل PCR في كل بئر من غير متجنب 96 لوحة جيدا. ماصة مكرر يمكن توفير الوقت لهذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المناسب من البعوض في كل بئر. ملاحظة: عملية الحصول على الحمض النووي الجيني من م<html> الأنسجة osquito (رئيس / الصدر، البطن أو الجسم كله) يوصف في الآداب الأخرى 29-32. اختيار بروتوكول استخراج الحمض النووي المناسب للتمييز ذوي المتصورة في الدم (البطن) من البعوض المعدية (المتصورة في الرأس / الصدر). نحن عادة استخدام الحمض النووي المستخرج من أجزاء الجسم (الرأس / الصدر أو البطن) من البعوض، لذلك تركيز الحمض النووي يختلف من 0.05-2ng / ميكرولتر. على الرغم من أن مجموع المدخلات DNA هو أقل من توصية الشركة الصانعة (5-10ng / rxn)، ونحن عادة ما تحصل قوي SNP يدعو من 98٪ من عينات من الحمض النووي من دون كله تضخيم الجينوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة، بلطف مزيج أو الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 370 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام بروتوكول thermocycler التالية لتنفيذ PCR التضخيم: (1) 94 ° C لمدة 2 دقيقة، (2) 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، (3) 56 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، (4) 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (5) كرر الخطوة (2) - (4) لمدة 45 دورات، (6) 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 4 ° C الانتظار. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. العلاج SAP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل انزيم SAP في 96 لوحة جيدا (انظر الجدول 2). معالجة 96 عينة في طبق من ذهب. ويشمل حجم ردود الفعل لمدة 96 فائض من 20٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أنبوب من SAP حل انزيم بخفة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 2،000 ز س. الاستغناء 2 ميكرولتر من محلول أنزيم SAP في كل بئر. مرة أخرى، يمكن ماصة مكرر توفير الوقت لهذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة، بلطف مزيج أو الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 370 ز س. احتضان لوحة على النحو التالي: (1) 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة، (2) 85 ° C لمدة 5 دقائق لإبطال نشاط الانزيم، (3) 4 ° C الانتظار. في الانتهاء من هذه الخطوة، وتخزين لوحة عند -20 درجة مئوية قبل المتابعة. معالجة لوحة المخزنة في حدود 2 أسابيع. </li></ol> 3. SNP التمديد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تجميدها لوحة عينة بعد العلاج SAP، والسماح لها ذوبان الجليد لRT قبل المتابعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج تمديد التمهيدي (التكميلي الجدول S2). كل SNP ديه EXTE واحدnsion التمهيدي. الحفاظ على تركيز المخزون من كل التمهيدي التمديد في 500 ميكرومتر. اختياريا، قسامة عن 100-200 ردود الفعل في أنبوب وتخزينها في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تمديد مزيج كما هو موضح في الجدول رقم 3. ويضم 96 حجم رد الفعل فائض من 20٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أنبوب التمديد كوكتيل بخفة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 2،000 ز س. الاستغناء 2 ميكرولتر من الكوكتيل التمديد في كل بئر. مرة أخرى، يمكن ماصة مكرر توفير الوقت لهذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم لوحة، بلطف مزيج أو الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 370 ز س. Thermocycle لوحة كما هو مبين في الشكل (1). وعند هذه النقطة، انتقل إلى قياس الطيف الكتلي أو تخزين لوحة عند -20 درجة مئوية لتصل إلى 2 أسابيع. </li></ol> 4. تكييف ملحق المنتج SNP لتحسين تحليل الطيف الكتلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم تجميدها لوحة عينة بعد التمديد SNP، والسماح لها ذوبان الجليد لRT قبل المتابعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 15MG من راتنج من المآخذ لهاINER على لوحة الدمل باستخدام ملعقة ممدود. استخدام مكشطة لنشر الراتنج في الآبار من لوحة الدمل. اكتساح مكشطة من جانب إلى آخر عبر لوحة الدمل لنشر الراتنج. تأكد من وجود الراتنج في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط الراتنج الزائد لوحة الدمل باستخدام مكشطة. السماح للراتنج يقف في لوحة الدمل لمدة 20 دقيقة على الأقل. في حين ترك الراتنج تقف في لوحة الدمل، إضافة 41 ميكرولتر من HPLC المياه الصف إلى كل بئر من لوحة عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف لوحة عينة رأسا على عقب، على لوحة الدمل. تأكد من إعادة تعيين لوحة عينة ضد آخر مدورة صغيرة من لوحة الدمل، حيث يتقابل الآبار في لوحة عينة مع الآبار في لوحة الدمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد لوحة عينة ولوحة الدمل معا، والوجه لهم بلطف على ذلك يندرج الراتنج من لوحة الدمل في الآبار من لوحة عينة. اضغط على لوحة الدمل حتى يسقط الراتنج للخروج الى لوحة العينة. تأكد من أن جميع الراتنج في دي<html> تقع لوحة mple للخروج الى الآبار لوحة العينة. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 3،200 x ج لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير لوحة عينة على محور دوار لمدة 5 دقائق على RT. الدوار يجب تدوير لوحة عينة 360 درجة حول محور طويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة عينة في 3،200 x ج لمدة 5 دقائق. بعد هذه الخطوة، وتخزين لوحة عينة في -20 ° C لتصل إلى 2 أسابيع قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. </li></ol> 5. MALDI-TOF الطيف الكتلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل SNP المنتج تمديد مكيفة الصعود إلى bioarray مثل SpectroCHIP حسب تعليمات الشركة الصانعة. نحن نستخدم MassArray Nanodispenser لهذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة اكتمال عملية النقل، وتحديد كيف المقايسات واللوحات هي التي يتم إقامتها في قاعدة البيانات الفحص. اسم الفحص واللوحات بحيث كل لوحة لديها معرف فريد الذي يربط إلى تصميم فحص معين (التكميلي الجدول S3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم تعريف الفحص ولوحة، واكتساب الأطياف باستخدام مطياف الكتلة. </li></ol>الصورة = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل البيانات باستخدام الوقت الحقيقي تحليل PCR برنامج تفسير البيانات مثل من نوع محلل أو TyperViewer (Sequenom). الحصول على البيانات في. XML الشكل الذي يحتوي على تخطيط العينة، الطيفية الجماعية لكل بئر، فإن المعلومات بما في ذلك اسم علامة والكتلة المتوقعة لكل متغير من SNP المقابلة، وأي خطأ أو رسائل التحذير المرتبطة بكل رد فعل. انظر الشكل 2 لالناتجة الطيفية كتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تحليل SNP النمط الجيني التجميع عن طريق تحديد عتبة الكشف (حجم أو إشارة إلى نسبة الضوضاء) والتسامح / التباين المسموح بها لكل النمط الجيني الشكل يظهر 3 مثال على 04707-KDR # 2 SNP مجموعات التركيب الوراثي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير الناتجة المكالمات النمط الجيني SNP في برنامج جدول بيانات. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ويتكون MDA من خمس خطوات رئيسية هي: PCR التضخيم، رد فعل قلوية الروبيان الفوسفاتيز (SAP)، والإرشاد SNP، تكييف المنتج التمديد، وبمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين - الوقت الرحلة (MALDI-TOF) قياس الطيف الكتلي 33-37. أول خطوة التضخيم PCR تضخيم DNA المرافقة كل SNP بحيث DNA قالب يكفي ?...

ارابينسيس الأنوفيليس، الأنوفيليس coluzzii والأنوفيلة الغامبية هي ناقلات الرئيسية المسؤولة عن انتقال الملاريا في أفريقيا 1. هذه الأنواع الثلاثة هي شكليا تمييزه 2 و يمكن إلا أن يكون ميزت من قبل المقايسات الجزيئية 3-9. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من المقايسات المصب أجريت بشكل روتيني لمساعدة الوراثة الوبائية والسكان الدراسات. وتشمل هذه (1) مقايسة التنميط الجيني لأنواع جديدة الجزر 10-12، (2) مقايسة التنميط الجيني الاعتراف تعدد الأشكال غير مرادفة في 1014 عشر من الأحماض الأمينية موقف كودون من الفقرة الجين (المقاومة تدق إلى أسفل، أو KDR، SNP) 13 -18، (3) كشف الطفيلي PCR 19-23، و (4) لفحص الحمض النووي المضيف محددة في midguts البعوض 24،25. وضعنا مقايسة متعددة كشف (MDA) الذي يجمع بين كل هذه المقايسات إلى رد فعل واحد مع تعدد الإرسال مرماه من هدفalyzing الخصائص المهمة وبائيا لنواقل الملاريا في أفريقيا. ويشمل الفحص MDA علامات متعددة للكشف عن (1) أنواع (A. ارابينسيس، A. الغامبية، A. coluzzii، أو غيرها (أي من) ثلاثة)، (2) مقاومة الحشرات ممثلة في KDR تعدد الأشكال (سواء L1014F وL1014S) ، (3) وجود اثنين من طفيليات الملاريا الكبرى، المتصورة المنجلية وP. النشيطة، و (4) مصدر الدم من الطيور وستة المضيفين الثدييات. تقليديا، أجريت هذه المقايسات في التفاعلات منفصلة البلمرة المتسلسل. عندما تتم كل هذه المقايسات باستخدام منصة PCR التقليدية، فإنه يتطلب إجراء فحوصات 8-10 PCR رد فعل والمرافق هلام الخطوات الكهربائي. كل رد فعل PCR الفردية من الإعداد إلى النتائج توثيق يأخذ 4-5 ساعة، في حين أن طريقة MDA المقدمة هنا يستغرق حوالي 5 ساعة في مجملها. وهذا يعادل وفورات بنسبة 90٪ في تكاليف العمالة وحدها. قدم MDA هنا يكلف 5 $لكل عينة إلى التركيب الوراثي جميع النيوكلوتايد 33. هذا هو إلى حد كبير أقل تكلفة من فحوصات القائم على هلام الاغاروز واحدة، والتي تكلف نحو 1،50 $ لكل عينة. ان فحوصات الكشف عن الخصائص التي تغطيها MDA تتطلب ما لا يقل عن 8-10 المقايسات القائم على هلام الاغاروز منفصلة بتكلفة 12-15 دولارا للعينة. وعلاوة على ذلك، فإن MDA يقلل كثيرا من فرصة لتوليد كاذبة إيجابية أو سلبية من خلال الاستفادة من ثلاثة على الأقل من علامات لكل الطفيليات أو مصدر المضيف الكشف. منصة نحن المستخدمة لا يقتصر على نواقل الملاريا ولكن يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات مثل الطب، والطب البيطري، والبيولوجيا الأساسية 26-28. الدراسات جمعية أو علم الوراثة السكانية الدراسات التي تنطوي على كبير (في ترتيب 100S) عدد العينات تتطلب متعمقة المقايسات فعالة من حيث التكلفة لفحص علامات متعددة في وقت واحد. يمكن أن معظم الدراسات التي تستخدم اثنين أو أكثر من المقايسات PCR منفصلة تنفيذ MDA للحصول على نتائج أسرع وبتكلفة أقل. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="588">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Analyzer Compact</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">MT9</td>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">RS1000</td>
			<td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">10158</td>
			<td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

ويضم المجمع الأنواع الأنوفيلة الغامبية الملاريا رئيسيا نقل البعوض في أفريقيا. لأن هذه الأنواع هي بهذه الأهمية الطبية، وعادة ما تتميز بعدة صفات باستخدام المقايسات الجزيئية للمساعدة في الدراسات الوبائية. وتشمل هذه الصفات تحديد الأنواع، ومقاومة الحشرات، حالة عدوى الطفيليات، وتفضيل المضيف. منذ السكان من مجمع الأنوفيلة الغامبية لا يمكن تمييزها شكليا، يتم استخدام سلسلة البوليميراز رد فعل (PCR) تقليديا لتحديد الأنواع. مرة واحدة ومن المعروف أن الأنواع، ويتم تنفيذ عدة فحوصات المصب بشكل روتيني لتوضيح المزيد من الخصائص. على سبيل المثال، والطفرات المعروفة باسم KDR في جين الفقرة تمنح مقاومة ضد DDT والمبيدات الحشرية البيروثرويدات. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام فحوصات انزيم مرتبط المناعي (ELISAs) أو المتصورة كشف DNA الطفيلي المقايسات PCR للكشف عن الطفيليات الموجودة في الأنسجة البعوض. وأخيرا، فإن combinatioن من PCR وتقييد انزيم هضم يمكن استخدامها لتوضيح تفضيل المضيف (على سبيل المثال، الإنسان مقابل دم الحيوانات) من خلال فحص وbloodmeal البعوض لDNA المضيف محددة. قمنا بتطوير فحص متعددة كشف (MDA) الذي يجمع بين كل من المقايسات المذكورة أعلاه في واحد متعدد 33SNPs التنميط الجيني رد فعل لمدة 96 أو 384 عينات في وقت واحد. لأن MDA يتضمن علامات متعددة الأنواع، والكشف عن المتصورة، وتحديد الدم المضيف، يتم تقليل احتمال توليد ايجابيات كاذبة أو السلبيات كثيرا من فحوصات السابقة التي تتضمن علامة واحدة فقط لكل سمة. هذا الاختبار قوي وبسيط يمكن الكشف عن هذه الصفات البعوض الرئيسية على نحو فعال من حيث التكلفة وفي جزء من الوقت من المقايسات القائمة.

تحديد الأنواع: وفيما يلي 5 النيوكلوتايد تحديد معا ثلاثة أنواع (A. ارابينسيس، A. coluzzii وA. الغامبية) (جدول 4). إذا عينة ليست واحدة من الأنواع الثلاثة، وتعدد الأشكال الثلاثة (01073-213، 04679-157 و10313 -052) تفشل لتضخيم. <p class...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes at JoVE.com

مقايسة متعددة الكشف عن الملاريا التي تنقل البعوض | الأحياء | فيديو

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Evolution

Speciation and Diversity

SCIENTISTS IN ACTION

13.0K Views.  School of Veterinary Medicine, University of California - Davis. Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Video: A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

حقن آن. stephensi الجنين لتوليد الملاريا مقاومة البعوض

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

بروتوكول للعدوى حمى الضنك في البعوض (بعوض ألف) ، وتحديد النمط الظاهري العدوى

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

بروتوكول للتربية البعوض (A. الغامبية)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

بروتوكول للعدوى الملاريا المنجلية في تحديد النمط الظاهري البعوض والعدوى

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Population Replacement Strategies for Controlling Vector Populations and the Use of Wolbachia pipientis for Genetic Drive

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population replacement" is the replacement of wild vector populations (that are competent to transmit pathogens) with those that are not competent to transmit pathogens. There are several theoretical strategies to accomplish this. One is to exploit the maternally-inherited symbiotic bacteria Wolbachia pipientis. Wolbachia is a widespread reproductive parasite that spreads in a selfish manner at the extent of its host's fitness. Jason Rasgon discusses, in detail, the basic biology of this bacterial symbiont and various ways to use it for control of vector-borne diseases.

In this interview, Jason Rasgon explains the concept of genetic drive and the characteristics of an effective gene drive system. The use of the endosymbiotic bacterium, Wolbachia pipientis, as a means to spread genes through mosquito populations, is hypothesized.

الاستراتيجيات السكانية لاستبدال النواقل مراقبة واستعمال pipientis الولبخية لمحرك الوراثية

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

بروتوكول للفحوصات رني في البعوض الكبار (A. الغامبية)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

منع انتشار الملاريا وحمى الضنك عن طريق البعوض المعدل وراثيا

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

بناء عالم أفضل البعوض : تحديد الجينات تمكين الملاريا وحمى الضنك حمى المقاومة في الغامبية ألف وألف البعوض بعوض

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several genera of these whitefly-transmitted plant viruses (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) include several hundred species of emerging and economically significant pathogens of important food and fiber crops (reviewed by9,10,16). These viruses do not replicate in their vector but nevertheless are moved readily from plant to plant by the adult whitefly by various means (reviewed by2,6,7,9,10,11,17). For most of these viruses whitefly feeding is required for acquisition and inoculation, while for others only probing is required. Many of these viruses are unable or cannot be easily transmitted by other means. Therefore maintenance of virus cultures, biological and molecular characterization (identification of host range and symptoms)3,13, ecology2,12, require that the viruses be transmitted to experimental hosts using the whitefly vector. In addition the development of new approaches to management, such as evaluation of new chemicals14 or compounds15, new cultural approaches1,4,19, or the selection and development of resistant cultivars7,8,18, requires the use of whiteflies for virus transmission. The use of whitefly transmission of plant viruses for the selection and development of resistant cultivars in breeding programs is particularly challenging7. Effective selection and screening for resistance employs large numbers of plants and there is a need for 100% of the plants to be inoculated in order to find the few genotypes which possess resistance genes. These studies use very large numbers of viruliferous whiteflies, often several times per year.
Whitefly maintenance described here can generate hundreds or thousands of adult whiteflies on plants each week, year round, without the contamination of other plant viruses. Plants free of both whiteflies and virus must be produced to introduce into the whitefly colony each week. Whitefly cultures must be kept free of whitefly pathogens, parasites, and parasitoids that can reduce whitefly populations and/or reduce the transmission efficiency of the virus. Colonies produced in the manner described can be quickly scaled to increase or decrease population numbers as needed, and can be adjusted to accommodate the feeding preferences of the whitefly based on the plant host of the virus.
There are two basic types of whitefly colonies that can be maintained: a nonviruliferous and a viruliferous whitefly colony. The nonviruliferous colony is composed of whiteflies reared on virus-free plants and allows the weekly availability of whiteflies which can be used to transmit viruses from different cultures. The viruliferous whitefly colony, composed of whiteflies reared on virus-infected plants, allows weekly availability of whiteflies which have acquired the virus thus omitting one step in the virus transmission process.

Improving our understanding of and our ability to manage many of the insect-transmitted plant viruses requires the use of the vector. Insect transmission of plant viruses is a tritrophic interaction, and as such requires the manipulation of insects, virus, and plant. Vectors must be reared in large numbers and manipulated in such a way as to insure high rates of transmission to test plants. The basics of rearing and manipulating the whitefly, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), a vector of plant viruses belonging to several emerging plant virus genera, representing a large number of economically significant viruses is presented.

يحيل الفيروسات النباتية عن طريق الذباب الأبيض

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

فحوصات السمية للاختبار تأثيرات جينية من المخدرات للتنمية، الخصوبة والوراثة من الملاريا البعوض

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...