Bu protokol, gen tarafından düzenlenen sivrisinek popülasyonlarında Indel mutasyonlarının yaygınlığını ve göreceli miktarını belirleyebilen NHEJ analizi için yüksek verim ve güvenilir bir makyaj sağlar. Bir sonraki nesil veya Sanger dizilimi ile karşılaştırıldığında, ddPCR, genetik varyasyonun genetiği değiştirilmiş organizmalar için hızlı ve eksiksiz bir şekilde analiz edilmesine izin veren sonuçlar için daha hızlı geri dönüş süresine sahiptir. Bu yöntem genel olarak tüm deneysel sistemler için geçerli olmalıdır.
Prosedürü gösteren, Yang'ın laboratuvarından bir personel araştırma görevlisi olan Thai Pham olacak. Başlangıç olarak, metinde açıklanan oranlarda ddPCR süper karışım, ileri ve ters astarlar, HEX veya FAM probları, DNA ve su ekleyerek dijital damlacık PCR veya ddPCR örnek karışımının 25 mikrolitresini hazırlayın. Daha sonra girdapla reaksiyonun iyice karıştırılması.
50 mikrolitrelik çok kanallı pipet kullanarak, ddPCR numune karışımının 20 mikrolitresini kartuşun orta sırasına yükleyin. Daha sonra pipetleme boyunca kabarcıklar üretmeden yağın 70 mikrolitresini alt sıraya yüklemek için 200 mikrolitrelik çok kanallı bir pipet kullanın. Contayı sadece kenarlara dokunarak, merkezden, betondan bölgeden kaçınarak yerleştirin ve ardından plakayı damlacık jeneratörüne güvenli bir şekilde yerleştirin ve çalıştırmayı başlatmak için kapağı kapatın.
Daldırma karışımını kartuşun üst sırasından 96 kuyu plakasına aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve 30 ila 45 derecelik bir açıyla üç ila beş saniye boyunca 40 mikrolitre sıvı numune bırakın. Daha sonra karışımı 45 derecelik bir açıyla üç saniyeden fazla yavaşça kuyuya atın, yandan aşağı düşmesine izin verin ve ardından sıvıyı tamamen dışarı atmak için pipetin ikinci durağına gidin. Folyo ısı contalarını kullanarak plakaları 180 santigrat derecede beş saniye kapatın.
Mühürlü plakayı termositlere yerleştirin ve ilk denatürasyonu 10 dakika boyunca 95 santigrat dereceye ayarlayarak NHEJ bırakma yönergeleri için PCR koşullarını ayarlayın. Ardından, denatüre etmek için 30 saniye boyunca 94 santigrat derecelik 40 döngü, bir dakikadan tavlaya 55 santigrat derece ve uzatmak için iki dakika boyunca 60 santigrat derece ayarlayın. 40 döngüden sonra, 10 dakika boyunca 98 santigrat derecede tutun ve dört santigrat derecede son tutuş yapın.
Tüm adımlar için saniyede iki santigrat derecelik bir rampa hızı kullanın. Tavlama sıcaklığı, kullanılan problara veya astara göre değişecektir. Plakayı, sol üstte iyi etiketlenmiş A1 ile damlacık okuyucuya güvenli bir şekilde yerleştirin.
Programı açın ve FAM'ı bilinen referans kanalı ve HEX'i her kuyu için bilinmeyen kanal olarak belirleyerek plakayı ayarlayın. Ardından, her örneğin adını değiştirin. Şablonu kaydederken damlacık okuma deneyini doğrudan niceleme olarak çalıştırın.
Yazılım analizi için doğru deneysel parametreleri belirleyin, yani örnek bilgiler, süper karışım, hedef adı, hedef türü, sinyal kanalı bir ve kanal iki. Ardından, güvenilir sonuçlar için damlacık sayısı eşiğini 10.000'in üzerine ayarlayın. Ardından, damlacık sekmesindeki her kuyu için damlacık sayısını kontrol edin ve hepsinin 10.000'in üzerinde olduğundan emin olun.
Son olarak, negatiflerden verimli sinyal ayırma için 1D genliği kontrol edin. Plaka düzenleyicisinde, tüm plakayı vurgulayın ve deneme türünü bırakacak şekilde ayarlayın. WT hedefini referans olarak ayarlayın, FAM için kanal 1 ve HEX için kanal 2'yi belirleyin.
NHEJ hedefini bilinmiyor olarak ayarlayın, FAM için kanal 1 ve kanal 2'yi yok olarak belirleyin. 2D genlik sekmesinde, her örnek için grafik araçlarıyla küme eşiklerini ayarlayın. Kuyruk normalde NHEJ tahlilleri için WT kümesi ile ilişkilidir.
Oran sekmesinin altında, grafiğin sağ üst kısmındaki dişli simgesine tıklayın ve NHEJ olaylarının yüzdesine karşılık gelen bir noktayı çizmek için kesirli bolluğu seçin. Her biri çeşitli NHEJ alelleri içeren 10 sivrisinekten oluşan 15 farklı çekilmiş örnek, bırakma tahlilleri kullanılarak analiz edildi ve tespit edildi ve sonuçlar 15 örneğin tamamının% 100 Indel alelleri taşıdığını gösterdi. Başka bir deneyde, farklı NHEJ yüzdelerine sahip 11 çekilmiş yabani tip sivrisinek ve NHEJ sivrisinek örneği bu ddPCR protokolü ile incelendi.
Sonuçlar, tanımlanan yüzdenin amplicon analiz tekniği ile Indel tespitine nispeten yakın olduğunu göstermiştir. Kabarcıkları önlemek için yavaşça pipet ve tüm emülsifiye damlacıkların kuyuların duvarından damlamasına izin verin.
