이 프로토콜은 유전자 편집 모기 집단에서 Indel 돌연변이의 보급 그리고 상대적인 양을 결정할 수 있는 NHEJ 분석을 위한 높은 처리량 및 믿을 수 있는 메이크업을 제공합니다. 차세대 또는 Sanger 시퀀싱에 비해 ddPCR은 유전자 변형 생물을 위한 유전자 변이의 신속하고 완전한 분석을 허용하는 결과에 대한 빠른 처리 시간을 가지고 있습니다. 이 방법은 일반적으로 모든 실험 시스템에 적용해야 합니다.
절차를 시연하는 것은 양 연구실의 직원 연구 동료인 타이 팜(Thai Pham)이 될 것입니다. 우선, ddPCR 슈퍼 믹스, 전방 및 역 프라이머, HEX 또는 FAM 프로브, DNA 및 물을 텍스트에 기재된 비율로 추가하여 디지털 액적 PCR 또는 ddPCR 샘플 믹스의 25 마이크로리터를 준비한다. 그런 다음 소용돌이에 의해 반응을 철저히 혼합합니다.
50 마이크로리터 멀티채널 파이펫을 사용하여 ddPCR 샘플 믹스의 20마이크로리터를 카트리지의 중간 행에 로드합니다. 그런 다음 200 마이크로리터 멀티채널 파이펫을 사용하여 파이펫 전체에 버블을 생성하지 않고 70마이크로리터의 오일을 하단 행에 로드합니다. 개스킷을 놓고 가장자리만 만지고 중앙, 컨캐빙 된 영역을 피한 다음 플레이트를 물방울 발생기에 단단히 놓고 덮개를 닫아 실행을 시작합니다.
카트리지의 상단 행에서 96웰 플레이트로 침수 믹스를 전송하려면 멀티채널 파이펫을 사용하고 40 마이크로리터의 액체 샘플을 30~45도 각도로 3~5초 간 떨어뜨립니다. 그런 다음 45도 각도로 3초 이상 천천히 우물안으로 혼합물을 배출하여 측면에서 떨어뜨린 다음 파이펫의 두 번째 정류장으로 이동하여 액체를 완전히 추방합니다. 호일 열 씰을 사용하여 180°C에서 5초 동안 플레이트를 밀봉합니다.
밀봉된 플레이트를 열순환기에 넣고 초기 소동을 섭씨 95도에서 10분 동안 설정하여 NHEJ 드롭 오프 가이드라인에 대한 PCR 조건을 설정합니다. 그런 다음 40°C의 섭씨 94도를 30초 간 설정하고, 1분에서 음막까지 섭씨 55도, 섭씨 60도를 2분간 연장합니다. 40사이클 후, 섭씨 98도에서 10분간, 마지막 홀드는 섭씨 4도에서 유지됩니다.
모든 단계에 대해 초당 섭씨 2도의 경사로 를 사용합니다. 어닐링 온도는 사용되는 프로브 또는 프라이머에 따라 달라집니다. 왼쪽 상단에 잘 표시된 A1이 있는 드롭렛 판독기에 플레이트를 단단히 배치합니다.
프로그램을 열고 FAM을 알려진 참조 채널로 지정하고 HEX를 각 웰에 대해 알 수 없는 채널로 지정하여 플레이트를 설정합니다. 그런 다음 각 샘플의 이름을 변경합니다. 템플릿을 저장하는 동안 액적 읽기 실험을 직접 정량화로 실행합니다.
소프트웨어 분석, 즉 샘플 정보, 슈퍼 믹스, 대상 이름, 대상 유형, 신호 채널 1 및 채널 2에 대한 올바른 실험 매개 변수를 지정합니다. 그런 다음 신뢰할 수 있는 결과를 위해 물방울 수에 대한 임계값을 10, 000 이상으로 설정합니다. 다음으로, 물방울 탭의 각 우물에 대한 물방울 수를 확인하여 모든 것이 10, 000 이상이되도록 합니다.
마지막으로 1D 진폭을 확인하여 네거티브로부터의 효율적인 신호 분리를 확인하십시오. 플레이트 편집기에서 전체 플레이트를 강조 표시하고 실험 유형을 드롭오프하도록 설정합니다. WT 대상을 참조로 설정하고 FAM용 채널 1을 지정하고 HEX용 채널 2를 지정합니다.
NHEJ 대상을 알 수 없는 것으로 설정하여 FAM용 채널 1과 채널 2를 없음으로 지정합니다. 2D 진폭 탭에서 각 샘플에 대한 그래프 도구로 클러스터 임계값을 설정합니다. 꼬리는 일반적으로 NHEJ 에세이에 대한 WT 클러스터와 연관됩니다.
비율 탭에서 그래프 오른쪽 상단의 기어 아이콘을 클릭하고 분수 풍부를 선택하여 NHEJ 이벤트의 백분율에 해당하는 점을 플롯합니다. 15개의 모기의 15개의 상이한 뽑아낸 견본은 각각 각종 NHEJ 대립구도를 포함하고, 분석되고 드롭오프 분석해서 확인되고, 결과는 15개의 견본이 모두 100% Indel 대립을 운반했다는 것을 보여주었습니다. 또 다른 실험에서는, 11다른 NHEJ 백분율을 가진 야생 모형 모기와 NHEJ 모기의 11개의 뽑아낸 견본이 ddPCR 프로토콜로 검토되었습니다.
그 결과 확인된 백분율이 앰플리카 분석 기술에 의한 인델 검출에 비교적 가깝다는 것을 보여주었다. 피펫은 천천히 거품을 피하고 유화 된 모든 물방울이 우물의 벽을 떨어 뜨릴 수 있도록합니다.
