يسمح هذا البروتوكول بتكوين خلايا سرطانية نقلية في الدماغ وتوليد شرائح دماغية خارج الجسم الحي تسمح بإجراء اختبار سريع لفعالية الدواء والإشعاع على ورم مسبق التشكيل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على اختبار العديد من الأدوية أو العلاجات بسرعة في بيئة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية تحافظ على التفاعلات بين الدماغ والورم والمضيف. قد تساعد هذه الطريقة في فهم كيفية نمو خلايا الدماغ النقيلية والبقاء على قيد الحياة وغزو حمة الدماغ وفهم دور البيئة الدقيقة لورم الدماغ في نمو السرطان وانتشاره.
ستوضح الإجراءات لوريلا سيراكو وإميلي إسكيا ، وكلاهما مرشحان لدرجة الدكتوراه من مختبري. للبدء ، مع وضع الفئران المخدرة في إطار مجسمة وشل حركة الرأس باستخدام قضبان الأذن القياسية. تعقيم سطح الرأس ثلاث مرات عن طريق التطبيق المتكرر بالتناوب لمسحات اليود و 70٪ من الإيثانول قبل الشق.
باستخدام مشرط جراحي ، قم بعمل شق خط الوسط بطول سنتيمتر واحد بزاوية قطرية إلى المحور الوهمي الذي يقسم دماغ الفئران إلى نصفين متماثلين لفضح الجمجمة. بعد مسح أي دم باستخدام قطعة قطن ، قم بتحويل الجلد أفقيا لفضح موقع الحقن. استخدم بت نتوء 0.73 ملم لاختراق الجمجمة وحفر ثقب باستخدام ضغط طفيف وحركة التواء.
لحقن خمسة ميكرولترات من الخلايا التي تعبر بثبات عن GFP luciferase ، أدخل حقنة عالية الدقة إلى عمق 3.5 ملم في الدماغ. اتركه يستقر لمدة دقيقتين ثم اسحب المحقنة لأعلى حوالي ملليمتر واحد. بعد دقيقتين ، حقن حجم النصف الأول ببطء وانتظر لمدة دقيقتين أخريين قبل حقن بقية الحجم.
بعد ثلاث دقائق ، اسحب المحقنة ببطء. ضع شمع العظام على موقع الحقن على الجمجمة وقم بخياطة الأنسجة بخيوط البولي بروبلين. راقب سلوك الفأر مباشرة بعد الجراحة بشكل دوري لتحديد ما إذا كانت هناك حاجة إلى علاج خاص ، بما في ذلك الحقن الملحي والأغذية اللينة ، للمساعدة في الشفاء السريع.
لمراقبة نمو الورم عن طريق التصوير بالتلألؤ الحيوي ، قم أولا بتشغيل الأكسجين والأيزوفلوران على نظام التصوير والسماح بتوزيعهما على الغرفة المنفصلة خارج صندوق التصوير. بعد ذلك ، بعد تشغيل البرنامج وتهيئة الأداة ، حدد الخيار المناسب لتصور والتقاط جسم الماوس بأكمله. بعد ذلك ، انقل الفئران إلى الغرفة خارج صندوق التصوير المزود بالأكسجين والأيزوفلوران.
بمجرد أن تكون الفئران تحت تأثير التخدير ، حقن الفئران داخل الصفاق مع 200 ميكرولتر من 30 ملليغرام لكل ملليلتر من لوسيفيرين. ضع الفئران في غرفة التصوير مع توجيه المعدة لأسفل إلى شفة الأنف في غرف التصوير. قم بقفل الغرفة ، واختر التعرض لمدة دقيقتين لبدء التصوير ، ثم أكمل التصوير.
بعد وضع قطاعة الأنسجة في غطاء تدفق صفحي معقم ، قم بتنظيف جميع الأدوات والأدوات باستخدام 70٪ من الإيثانول. بعد القتل الرحيم للفأر ، قم بإزالة الدماغ ووضعه بسرعة في محلول السكروز البارد المثلج ACSF. باستخدام ملعقة، انقل الدماغ على ورقة ترشيح مبللة ب ACSF على غطاء طبق 60 ملم.
باستخدام شفرة حلاقة حادة ومعقمة ، قم بقطع الأجزاء الزائدة من الدماغ التي لا تحتوي على أي ورم ، بما في ذلك الجزء السفلي من الدماغ ، لجلب شكل الدماغ إلى مكعب غير مثالي. بعد وضع عدة أوراق من ورق الترشيح المبلل ب ACSF على منصة القطع ، ضع الأنسجة المسدودة على ورق الترشيح. لتقطيع الأنسجة إلى أقسام بسماكة 200 إلى 250 ميكرومتر، اضبط حجم القطع على وحدتين أو 2.5 وحدة على مسطرة الموفر وابدأ القطع.
استخدم فرشاة الطلاء لنقل شرائح الدماغ إلى طبق يحتوي على السكروز ACSF وفصل الشرائح تحت المجهر الضوئي باستخدام إبر قياس 27. تحديد الشرائح الإيجابية GFP تحت المجهر الفلوري. بعد ذلك ، باستخدام ماصة معقمة مكسورة سعة ملليلتر واحد مع فتحة واسعة ، انقل الشرائح المحددة إلى طبق جديد بحجم 60 ملم يحتوي على ملليلتر إلى ثلاثة ملليلتر من وسائط شرائح البالغين.
ثم ، انقل ثلاث إلى خمس شرائح إلى كل مزرعة أنسجة يتم إدخالها في كل بئر من صفيحة من ستة آبار على مسافة آمنة. بعد إزالة الوسط الزائد من سطح الإدراج ، أضف ملليلتر واحد من وسط شريحة الماوس البالغ المتوازن أسفل كل إدراج. احتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون ، و 95 ٪ من الرطوبة لمدة 24 ساعة قبل التصوير.
ماصة خمسة ميكرولترات من 30 ملليغرام لكل محلول لوسيفيرين ملليلتر في الوسط تحت الإدخالات داخل غطاء محرك السيارة المعقم. ضع اللوحة ذات الستة آبار مع الغطاء داخل غرفة التصوير الخاصة بالأداة أسفل الكاميرا الثابتة وقم بقفل باب الغرفة. افتح البرنامج وقم بتهيئة الأداة.
بعد اختيار إعدادات الكاميرا التي تسمح بالتصور والتقاط بئر واحد فقط لكل صورة، ضع البئر المراد تصويره مباشرة تحت الكاميرا. استخدم أداة عائد الاستثمار ، وقم بتركيبها حول شكل الورم وحجمه ، وقم بقياس عائد الاستثمار ، وأبلغ عن إجمالي القراءات لتحديد إشارة اللمعان الحيوي لكل ورم على الشريحة. بعد إعادة اللوحة إلى غطاء التدفق الرقائقي المعقم ، استخدم الملقط لرفع الإدراج قليلا من البئر.
بعد شفط الوسط ، استبدل الوسط بملليلتر واحد من الوسط الطازج وضع الجزء الداخلي مرة أخرى في البئر. بالنسبة للتجارب التي يتم فيها معالجة الشرائح بمركبات مختلفة ، مثل المثبطات والأيضات ، قم بإعداد تركيز الكاشف المناسب في 1.2 ملليلتر من وسائط شريحة الدماغ في أنبوب 1.5 ملليلتر ، ثم انقل ملليلتر واحد من الكاشف إلى البئر الذي يحتوي على الشريحة. تم حقن خلايا لوسيفيراز MDA-MB-231 BR-GFP في الفئران العارية ، وسمح للأورام بالنمو ، وتم تشريح الأدمغة المصابة بالأورام ، وتقطيعها ، ونموها خارج الجسم الحي ، وتم مراقبة نمو الورم عن طريق التصوير بالتلألؤ الحيوي.
أكد تلطيخ H & E والتألق الإيجابي GFP وجود ورم في شريحة الدماغ. أكدت زيادة تلطيخ Ki-67 وجود خلايا سرطانية عالية التكاثر. استمرت الأورام في شرائح الدماغ التي لم تتعرض للتشعيع في النمو خارج الجسم الحي ، في حين أظهرت الأورام المعرضة للتشعيع نموا متوقفا.
كما تمت مراقبة شرائح الدماغ التي تحتوي على أورام عن طريق التصوير الحي لتصور نمو الورم بعد العلاج الإشعاعي. تمشيا مع التصوير الحيوي ، نمت الخلايا السرطانية السيطرة بسرعة مع زيادة كثافة GFP وبدأت الخلايا تغزو حمة الدماغ. في المقابل ، كانت الخلايا السرطانية في شرائح الدماغ المعالجة بالتشعيع مثبطة للخلايا وتم الحفاظ على كثافة GFP.
تم الكشف عن خلايا سرطانية كبيرة متعددة النوى وزيادة في تلطيخ علامة تلف الحمض النووي في الخلايا السرطانية المعالجة بالأشعة تحت الحمراء. أيضا ، تم الكشف عن زيادة في الخلايا النجمية التفاعلية. لم يتم الكشف عن موت الخلايا المبرمج الناجم عن العلاج بالأشعة تحت الحمراء في شرائح دماغ الفئران الخالية من الورم.
عولجت شرائح الدماغ التي تحتوي على أورام بتركيزات مختلفة من باكليتاكسيل ، وهو دواء للعلاج الكيميائي. قلل العلاج من حجم الورم بشكل كبير بعد اليوم 10 من العلاج. تم الكشف عن زيادة في موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية المعالجة بالباكليتاكسيل.
لم يغير العلاج المثبط من صلاحية أنسجة المخ. لم يتم قياس أي زيادة في موت الخلايا المبرمج عن طريق تلطيخ كاسباز-3 المشقوق في شريحة دماغ الفئران الخالية من الورم المعالجة بالباكليتاكسيل. عندما ينتهي العلاج بالأدوية ذات الأهمية ، يمكن تحليل الشرائح للتعبير عن البروتين من خلال الكيمياء المناعية ، أو دراسات omic ، أو تحقيق تعليق أحادي الخلية مناسب لقياس التدفق الخلوي.
