Bu protokol, beyin metastatik tümör hücrelerinin oluşumuna ve önceden oluşturulmuş bir tümör üzerinde ilaç etkinliğinin ve radyasyonun hızlı bir şekilde test edilmesini sağlayan ex vivo beyin dilimlerinin üretilmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, beyin-tümör-konakçı etkileşimlerini koruyan fizyolojik olarak ilgili bir ortamda birden fazla ilacı veya tedaviyi hızlı bir şekilde test etme yeteneğidir. Bu yöntem, beyin metastatik hücrelerinin beyin parankiminin nasıl büyüdüğünü, hayatta kaldığını ve istila ettiğini anlamaya yardımcı olabilir ve beyin tümörü mikroçevresinin kanser büyümesi ve yayılmasındaki rolünü anlamaya yardımcı olabilir.
Prosedürü gösterenler, her ikisi de laboratuvarımdan doktora adayı olan Lorela Ciraku ve Emily Esquea olacak. Başlamak için, anestezi uygulanan fareleri stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve standart kulak çubuklarını kullanarak kafayı hareketsiz hale getirin. Kesiden önce iyot çubuklarının ve% 70 etanolün tekrarlanan alternatif uygulaması ile başın yüzeyini üç kez sterilize edin.
Cerrahi bir neşter kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için farelerin beynini iki simetrik yarıya bölen hayali eksene çapraz açıyla bir santimetrelik bir orta hat kesisi yapın. Herhangi bir kanı pamuklu çubukla sildikten sonra, enjeksiyon bölgesini açığa çıkarmak için cildi yanal olarak saptırın. Kafatasına nüfuz etmek için 0,73 milimetrelik bir çapak ucu kullanın ve hafif basınç ve büküm hareketi kullanarak bir delik açın.
GFP lusiferazı sabit bir şekilde eksprese eden beş mikrolitre hücreyi enjekte etmek için, beyne 3,5 milimetre derinliğe kadar yüksek hassasiyetli bir şırınga yerleştirin. İki dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve ardından şırıngayı yaklaşık bir milimetre yukarı çekin. İki dakika sonra, ilk yarım hacmi yavaşça enjekte edin ve hacmin geri kalanını enjekte etmeden önce iki dakika daha bekleyin.
Üç dakika sonra, şırıngayı yavaşça çekin. Kafatasındaki enjeksiyon bölgesine kemik balmumu uygulayın ve dokuyu polipropilen dikişlerle dikin. Hızlı iyileşmeye yardımcı olmak için tuzlu su enjeksiyonu ve yumuşak yiyecekler de dahil olmak üzere özel tedavinin gerekli olup olmadığını belirlemek için ameliyattan hemen sonra farenin davranışını periyodik olarak izleyin.
Biyolüminesans görüntüleme yoluyla tümör büyümesini izlemek için, önce görüntüleme sistemindeki oksijen ve izofluranı açın ve her ikisinin de görüntüleme kutusunun dışındaki ayrı odaya dağıtılmasına izin verin. Ardından, yazılımı açtıktan ve cihazı başlattıktan sonra, tüm fare gövdesini görselleştirmek ve yakalamak için uygun seçeneği belirleyin. Daha sonra, fareleri oksijen ve izofluran ile beslenen görüntüleme kutusunun dışındaki odaya aktarın.
Fareler anestezik etki altına girdikten sonra, farelere intraperitoneal olarak mililitre lusiferin başına 200 mikrolitre 30 miligram enjekte edin. Fareleri, midesi görüntüleme odacıklarının burun dudağına bakacak şekilde görüntüleme odasına yerleştirin. Odayı kilitleyin, görüntülemeye başlamak için iki dakika süre pozlamayı seçin ve ardından görüntülemeyi tamamlayın.
Doku dilimleyiciyi steril bir laminer akış başlığına yerleştirdikten sonra, tüm aletleri ve aletleri% 70 etanol ile temizleyin. Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, beyni hızla buz gibi soğuk sakaroz-ACSF çözeltisine çıkarın ve yerleştirin. Bir spatula kullanarak, beyni 60 milimetrelik bir çanak kapağı üzerinde ACSF ile ıslatılmış bir filtre kağıdına aktarın.
Keskin, steril bir tıraş bıçağı kullanarak, beynin şeklini mükemmel olmayan bir küpe getirmek için beynin alt kısmı da dahil olmak üzere herhangi bir tümör içermeyen fazla kısımlarını kesin. ACSF ile ıslatılmış birkaç filtre kağıdını kesme platformuna yerleştirdikten sonra, tıkanmış dokuyu filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Dokuyu 200 ila 250 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırmak için, kesme boyutunu sağlayıcı cetvel üzerinde 2 veya 2,5 birime ayarlayın ve kesmeye başlayın.
Beyin dilimlerini sakaroz-ACSF içeren bir kaba aktarmak için bir boya fırçası kullanın ve dilimleri 27 gauge iğneler kullanarak hafif bir mikroskop altında ayırın. GFP-pozitif dilimleri floresan mikroskop altında tanımlayın. Daha sonra, geniş bir açıklığa sahip steril bir mililitrelik kırık pipet kullanarak, tanımlanmış dilimleri iki ila üç mililitre yetişkin dilim ortamı içeren yeni bir 60 milimetrelik kaba aktarın.
Ardından, altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğundaki her doku kültürü ekine güvenli bir mesafede üç ila beş dilim aktarın. Fazla ortamı kesici ucun yüzeyinden çıkardıktan sonra, her kesici ucun altına bir mililitre dengeli yetişkin fare dilimi ortamı ekleyin. Görüntülemeden önce dokuları 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte ve% 95 nemde inkübe edin.
Pipet, mililitre başına beş mikrolitre 30 miligram lusiferin çözeltisini steril bir başlık içindeki eklerin altındaki ortama yerleştirin. Altı delikli plakayı, kapağı cihazın görüntüleme odasının içine yerleştirerek sabit kameranın altına yerleştirin ve hazne kapağını kilitleyin. Yazılımı açın ve cihazı başlatın.
Görselleştirmeye ve görüntü başına yalnızca bir kuyucuğun yakalanmasına izin veren kamera ayarlarını seçtikten sonra, görüntülenecek kuyuyu doğrudan kameranın altına yerleştirin. ROI aracını kullanın, tümör şeklinin ve boyutunun etrafına yerleştirin, ROI'yi ölçün ve dilimdeki her tümörün biyolüminesan sinyalini ölçmek için toplam okumaları raporlayın. Plakayı steril laminer akış başlığına geri getirdikten sonra, kesici ucu kuyudan hafifçe kaldırmak için forseps kullanın.
Ortamı aspire ettikten sonra, ortamı bir mililitre taze ortamla değiştirin ve girişi tekrar kuyuya yerleştirin. Dilimlerin inhibitörler ve metabolitler gibi çeşitli bileşiklerle muamele edildiği deneyler için, 1.5 mililitrelik bir tüp içinde 1.2 mililitre beyin dilimi ortamında uygun reaktif konsantrasyonunu hazırlayın ve ardından bir mililitre reaktifi dilimi içeren kuyuya aktarın. MDA-MB-231 BR-GFP lusiferaz hücreleri çıplak farelere enjekte edildi, tümörlerin büyümesine izin verildi, tümörlü beyinler diseke edildi, dilimlendi, ex vivo büyütüldü ve tümör büyümesi biyolüminesans görüntüleme ile izlendi.
H & E boyama ve GFP-pozitif floresan, beyin diliminde bir tümörün varlığını doğruladı. Artmış Ki-67 boyaması, yüksek proliferatif kanser hücrelerinin varlığını doğruladı. Işınlamaya maruz kalmayan beyin dilimlerindeki tümörler ex vivo büyümeye devam ederken, ışınlamaya maruz kalan tümörler durmuş bir büyüme gösterdi.
Tümör içeren beyin dilimleri, ışınlama tedavisini takiben tümör büyümesini görselleştirmek için canlı görüntüleme yoluyla da izlendi. Biyolüminesan görüntüleme ile tutarlı olarak, GFP yoğunluğu arttıkça ve hücreler beyin parankimini istila etmeye başladıkça kontrol kanseri hücreleri hızla büyüdü. Buna karşılık, ışınlama ile tedavi edilen beyin dilimlerindeki kanser hücreleri sitostatikti ve GFP yoğunluğu korundu.
Büyük çok çekirdekli kanser hücreleri ve IR ile tedavi edilen kanser hücrelerinde DNA hasar belirtecinin boyanmasında bir artış tespit edildi. Ayrıca, reaktif astrositlerde bir artış tespit edildi. IR tedavisine bağlı apoptoz, tümörsüz fare beyin dilimlerinde tespit edilmedi.
Tümörleri içeren beyin dilimleri, kemoterapötik bir ilaç olan farklı konsantrasyonlarda paklitaksel ile tedavi edildi. Tedavi, tedavinin 10. gününden sonra tümörün boyutunu önemli ölçüde azalttı. Paklitaksel ile tedavi edilen tümör hücrelerinde apoptozda artış saptandı.
İnhibitör tedavisi beyin dokusunun canlılığını değiştirmedi. Paklitaksel ile tedavi edilen tümörsüz fare beyin diliminde parçalanmış kaspaz-3 boyaması ile apoptozda artış ölçülmedi. İlgilenilen ilaçlarla tedavi sona erdiğinde, dilimler immünositokimya, omik çalışmalar yoluyla protein ekspresyonu için analiz edilebilir veya akış sitometrisi için uygun tek hücreli süspansiyon elde edilebilir.
