Этот протокол позволяет формировать метастатические опухолевые клетки мозга и генерировать срезы мозга ex vivo, что позволяет быстро тестировать эффективность лекарств и радиацию на предварительно сформированной опухоли. Основным преимуществом этого метода является возможность быстрого тестирования нескольких лекарств или методов лечения в физиологически значимых условиях, которые поддерживают взаимодействие мозг-опухоль-хозяин. Этот метод может помочь понять, как метастатические клетки мозга растут, выживают и вторгаются в паренхиму мозга, и понять роль микроокружения опухоли головного мозга в росте и распространении рака.
Продемонстрировать процедуру будут Лорела Чираку и Эмили Эскеа, кандидаты наук из моей лаборатории. Для начала поместите обезболенных мышей в стереотаксическую рамку и обездвижите голову с помощью стандартных ушных вкладышей. Стерилизуют поверхность головки трижды путем повторного попеременного нанесения йодных тампонов и 70% этанола перед разрезом.
Используя хирургический скальпель, сделайте сантиметровый разрез средней линии под диагональным углом к воображаемой оси, разделяющей мозг мышей на две симметричные половины, чтобы обнажить череп. После протирания любой крови ватным тампоном отклоните кожу вбок, чтобы обнажить место инъекции. Используйте 0,73-миллиметровый заусенец, чтобы проникнуть в череп и просверлить отверстие, используя небольшое давление и скручивающее движение.
Чтобы ввести пять микролитров клеток, стабильно экспрессирующих люциферазу GFP, вставьте высокоточный шприц на глубину 3,5 миллиметра в мозг. Дайте ему отстояться в течение двух минут, а затем потяните шприц вверх примерно на один миллиметр. Через две минуты медленно введите первую половину объема и подождите еще две минуты, прежде чем вводить остальную часть объема.
Через три минуты медленно потяните шприц. Нанесите костный воск на место инъекции на черепе и зашить ткань полипропиленовыми швами. Периодически контролируйте поведение мыши сразу после операции, чтобы определить, необходимо ли специальное лечение, включая инъекции физиологического раствора и мягкую пищу, чтобы помочь быстрому выздоровлению.
Чтобы контролировать рост опухоли с помощью биолюминесцентной визуализации, сначала включите кислород и изофлуран в системе визуализации и позвольте им распределить их в отдельную камеру за пределами коробки визуализации. Затем, после включения программного обеспечения и инициализации инструмента, выберите подходящий вариант визуализации и захвата всего тела мыши. Затем перенесите мышей в камеру за пределами коробки визуализации, снабженную кислородом и изофлураном.
Как только мыши окажутся под анестезирующим эффектом, вводят мышам внутрибрюшинно 200 микролитров по 30 миллиграммов на миллилитр люциферина. Поместите мышей в камеру визуализации животом лицом вниз к камере визуализации носовой губы. Заблокируйте камеру, выберите двухминутное время экспозиции, чтобы начать визуализацию, а затем завершите визуализацию.
После помещения слайсера ткани в стерильный ламинарный проточный вытяжку очистите все инструменты и инструменты 70% этанолом. После эвтаназии мыши удалите и поместите мозг быстро в ледяной раствор сахарозы-ACSF. С помощью шпателя перенесите мозг на смачиваемую ACSF фильтровальную бумагу на 60-миллиметровую крышку тарелки.
Используя острое, стерильное лезвие бритвы, отрежьте лишние части мозга, которые не содержат никакой опухоли, включая нижнюю часть мозга, чтобы довести форму мозга до неидеального куба. Поместив несколько листов смачиваемой ACSF фильтровальной бумаги на режущую платформу, поместите заблокированную ткань на фильтровальную бумагу. Чтобы разрезать ткань на участки толщиной от 200 до 250 микрометров, установите размер разреза на 2 или 2,5 единицы на линейке поставщика и начните резку.
Используйте кисть для переноса ломтиков мозга в чашку, содержащую сахарозу-ACSF, и отделяйте ломтики под световым микроскопом с помощью игл 27-го калибра. Определите GFP-положительные срезы под флуоресцентным микроскопом. Затем, используя стерильную одномилитровую отколовшуюся пипетку с широким отверстием, переложите идентифицированные ломтики в новую 60-миллиметровую посуду, содержащую два-три миллилитра взрослой срезовой среды.
Затем переложите от трех до пяти ломтиков на каждую культуру ткани, вставленную в каждую лунку шестилуночной пластины на безопасном расстоянии. После удаления лишней среды с поверхности вставки добавьте один миллилитр уравновешенного слоя взрослой мыши под каждую вставку. Инкубируйте ткани при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа и 95% влажности в течение 24 часов перед визуализацией.
Пипетка пять микролитров по 30 миллиграммов на миллилитр раствора люциферина в среду под вставками внутри стерильного капюшона. Поместите шестилуночную пластину с крышкой внутрь камеры визуализации инструмента под стационарной камерой и закройте дверцу камеры. Откройте программное обеспечение и инициализируйте инструмент.
После выбора настроек камеры, позволяющих визуализировать и захватывать только одну скважину на изображение, поместите колодец для изображения непосредственно под камерой. Используйте инструмент ROI, поместите его вокруг формы и размера опухоли, измерьте ROI и сообщите общие показания для количественной оценки биолюминесцентного сигнала каждой опухоли на срезе. После того, как пластина вернется к стерильному ламинарной вытяжке, используйте щипцы, чтобы слегка приподнять вставку из колодца.
После аспирации среды замените среду одним миллилитром свежей среды и поместите вставку обратно в колодец. Для экспериментов, где срезы обрабатывают различными соединениями, такими как ингибиторы и метаболиты, готовят соответствующую концентрацию реагента в 1,2 миллилитрах мозговой срезовой среды в 1,5-миллилитровой трубке, а затем переносят один миллилитр реагента в скважину, содержащую срез. Люциферазные клетки MDA-MB-231 BR-GFP вводили обнаженным мышам, опухолям разрешалось расти, мозг с опухолями рассекалывали, разрезали, выращивали ex vivo, а рост опухоли контролировали с помощью биолюминесцентной визуализации.
Окрашивание H&E и GFP-положительная флуоресценция подтвердили наличие опухоли в срезе мозга. Повышенное окрашивание Ki-67 подтвердило наличие высокопролиферативных раковых клеток. Опухоли в срезах мозга, которые не подвергались облучению, продолжали расти ex vivo, в то время как опухоли, подвергшиеся облучению, показали застопорившийся рост.
Срезы мозга, содержащие опухоли, также контролировались с помощью живой визуализации для визуализации роста опухоли после облучения. В соответствии с биолюминесцентной визуализацией, контрольные раковые клетки быстро росли по мере увеличения интенсивности GFP, и клетки начали вторгаться в паренхиму мозга. Напротив, раковые клетки в срезах мозга, обработанных облучением, были цитостатическими, а интенсивность GFP поддерживалась.
Были обнаружены крупные многоядерные раковые клетки и увеличение окрашивания маркера повреждения ДНК в ИК-обработанных раковых клетках. Также было обнаружено увеличение реактивных астроцитов. ИК-индуцированный апоптоз не был обнаружен в срезах мозга мыши без опухоли.
Срезы мозга, содержащие опухоли, обрабатывали различными концентрациями паклитаксела, химиотерапевтического препарата. Лечение значительно уменьшило размер опухоли после 10-го дня лечения. Увеличение апоптоза было обнаружено в опухолевых клетках, обработанных паклитакселом.
Лечение ингибитором не изменяло жизнеспособность тканей головного мозга. Увеличение апоптоза не было измерено расщепленным окрашиванием каспазы-3 в обработанном паклитакселом срезе мозга мыши без опухоли. Когда лечение препаратами, представляющими интерес, прекращено, срезы могут быть проанализированы на экспрессию белка с помощью иммуноцитохимии, омических исследований или достижения одноклеточной суспензии, подходящей для проточной цитометрии.
