פרוטוקול זה מאפשר היווצרות של תאי גידול גרורתיים במוח ויצירת פרוסות מוח ex vivo המאפשרות בדיקה מהירה של יעילות התרופה וקרינה על גידול מוכן מראש. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לבחון במהירות תרופות או טיפולים מרובים בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית השומרת על אינטראקציות מוח-גידול-מארח. שיטה זו עשויה לסייע בהבנת האופן שבו תאים גרורתיים במוח גדלים, שורדים ופולשים לפרנכימה במוח ולהבין את תפקידה של המיקרו-סביבה של גידולי המוח בצמיחה ובהתפשטות של סרטן.
מי שידגימו את ההליך יהיו לורלה צ'יראקו ואמילי אסקה, שתיהן דוקטורנטיות מהמעבדה שלי. בתור התחלה, עם למקם את העכברים המורדמים לתוך מסגרת סטריאוטקסית ולשתק את הראש באמצעות מוטות אוזניים סטנדרטיים. לעקר את פני השטח של הראש שלוש פעמים על ידי יישום לסירוגין חוזר ונשנה של ספוגיות יוד ו 70% אתנול לפני החתך.
באמצעות אזמל כירורגי, בצע חתך קו אמצע של סנטימטר אחד בזווית אלכסונית לציר הדמיוני המחלק את מוחם של העכברים לשני חצאים סימטריים כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר ניגוב כל דם עם צמר גפן, להסיט את העור לרוחב כדי לחשוף את מקום ההזרקה. השתמש בקטע בור של 0.73 מילימטר כדי לחדור לגולגולת ולטדוח חור באמצעות לחץ קל ותנועת פיתול.
כדי להזריק חמישה מיקרוליטרים של תאים המבטאים ביציבות GFP לוציפראז, החדירו במוח מזרק ברמת דיוק גבוהה לעומק של 3.5 מילימטרים. אפשרו לו להתיישב במשך שתי דקות ואז משכו את המזרק למעלה בערך מילימטר אחד. לאחר שתי דקות, להזריק באיטיות את המחצית הראשונה של הווליום ולהמתין עוד שתי דקות לפני הזרקת שארית הווליום.
לאחר שלוש דקות, משכו באיטיות את המזרק. החל שעוות עצם על אתר ההזרקה על הגולגולת ותפר את הרקמה עם תפרים פוליפרופילן. עקוב אחר התנהגות העכבר מיד לאחר הניתוח מעת לעת כדי לקבוע אם יש צורך בטיפול מיוחד, כולל הזרקת מלח ומזון רך, כדי לסייע בהתאוששות מהירה.
כדי לנטר את צמיחת הגידול באמצעות הדמיה ביולומינסנציה, הפעילו תחילה את החמצן והאיזופלורן במערכת ההדמיה ואפשרו לשניהם להתפזר לחדר הנפרד שמחוץ לתיבת ההדמיה. לאחר מכן, לאחר הפעלת התוכנה ואתחול המכשיר, בחר באפשרות המתאימה להדמיה וללכידה של כל גוף העכבר. לאחר מכן, העבר את העכברים לתא מחוץ לתיבת ההדמיה המסופקת עם חמצן ואיזופלורן.
ברגע שהעכברים נמצאים תחת אפקט ההרדמה, הזריקו לעכברים באופן תוך-צפקי 200 מיקרוליטרים של 30 מיליגרם למיליליטר של לוציפרין. הניחו את העכברים בתא ההדמיה כשהבטן פונה כלפי מטה אל שפת האף של תאי ההדמיה. נעל את התא, בחר חשיפה של שתי דקות כדי להתחיל בהדמיה ולאחר מכן השלים את ההדמיה.
לאחר הנחת חותך הרקמות במכסה זרימה למינרי סטרילי, נקו את כל הכלים והמכשירים עם 70% אתנול. לאחר המתת החסד של העכבר, הסר והנח את המוח במהירות לתמיסת סוכרוז-ACSF קרה כקרח. באמצעות מרית, העבירו את המוח על נייר מסנן רטוב ACSF על מכסה צלחת בקוטר 60 מ"מ.
באמצעות סכין גילוח חד וסטרילי, חתכו את החלקים העודפים במוח שאינם מכילים שום גידול, כולל החלק התחתון של המוח, כדי להביא את צורת המוח לקובייה לא מושלמת. לאחר הנחת מספר גיליונות של נייר מסנן רטוב ACSF על פלטפורמת החיתוך, הניחו את הרקמה החסומה על נייר הסינון. כדי לפרוס את הרקמה למקטעים בעובי של 200 עד 250 מיקרומטר, הגדר את גודל החיתוך ל-2 או 2.5 יחידות בסרגל הספק והתחל לחתוך.
השתמשו במברשת צבע כדי להעביר פרוסות מוח לתוך צלחת המכילה סוכרוז-ACSF ולהפריד את הפרוסות תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מחטים בעלות 27 מדים. זהה את הפרוסות החיוביות ל-GFP תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סטרילית של מיליליטר אחד שבורה עם פתח רחב, מעבירים פרוסות מזוהות לתבשיל חדש של 60 מילימטרים המכיל שניים עד שלושה מיליליטרים של מדיית פרוסות בוגרת.
לאחר מכן, העבירו שלוש עד חמש פרוסות על כל תוסף תרבית רקמה בכל באר של צלחת בת שש בארות במרחק בטוח. לאחר הסרת המדיום העודף מפני השטח של התוסף, הוסף מיליליטר אחד של מדיום פרוסת עכבר בוגר שיווי משקל מתחת לכל תוספת. דגירה של הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-95% לחות למשך 24 שעות לפני ההדמיה.
פיפט חמישה מיקרוליטרים של 30 מיליגרם לכל מיליליטר לוציפרין תמיסה לתוך המדיום שמתחת לתוספות בתוך מכסה המנוע הסטרילי. מניחים את צלחת ששת הבארים עם המכסה בתוך תא ההדמיה של המכשיר מתחת למצלמה הנייחת ונועלים את דלת החדר. פתח את התוכנה ואתחל את המכשיר.
לאחר בחירת הגדרות המצלמה המאפשרות הדמיה ולכידה של באר אחת בלבד לכל תמונה, מקם את הבאר שתצולם ישירות מתחת למצלמה. השתמש בכלי ROI, התאם אותו סביב הצורה והגודל של הגידול, מדוד את ההחזר על ההשקעה ודווח על הקריאות הכוללות כדי לכמת את האות הביו-לומינסנטי של כל גידול על הפרוסה. לאחר החזרת הצלחת למכסה הזרימה הלמינרי הסטרילי, השתמשו במלקחיים כדי להרים מעט את התוספת מהבאר.
לאחר שאיפת המדיום, החליפו את המדיום במיליליטר אחד של מדיום טרי והניחו את הכניסה בחזרה לבאר. עבור הניסויים שבהם הפרוסות מטופלות בתרכובות שונות, כגון מעכבים ומטבוליטים, מכינים את ריכוז הריאגנט המתאים ב-1.2 מיליליטר של מדיית פרוסות מוח בצינור של 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן מעבירים מיליליטר אחד של מגיב לבאר המכילה את הפרוסה. תאי הלוציפראז MDA-MB-231 BR-GFP הוזרקו לעכברים עירומים, גידולים הורשו לגדול, מוחות עם גידולים נותחו החוצה, נחתכו, גדלו ex vivo, וצמיחת הגידול נוטרה על ידי הדמיית bioluminescence.
צביעת H&E ופלואורסצנציה חיובית ל-GFP אישרו את נוכחותו של גידול בפרוסת המוח. הכתם המוגבר של Ki-67 אישר את נוכחותם של תאים סרטניים מתרבים מאוד. הגידולים בפרוסות המוח שלא נחשפו להקרנה המשיכו לצמוח ex vivo, בעוד שגידולים שנחשפו להקרנה הראו צמיחה מעוותת.
פרוסות מוח המכילות גידולים נוטרו גם הן באמצעות הדמיה חיה כדי לדמיין את צמיחת הגידול לאחר טיפול ההקרנה. בהתאם להדמיה הביולומינסנטית, תאי סרטן הבקרה גדלו במהירות ככל שעוצמת ה-GFP עלתה והתאים החלו לפלוש לפרנכימה המוחית. לעומת זאת, התאים הסרטניים בפרוסות המוח שטופלו בהקרנה היו ציטוסטטיים ועוצמת ה-GFP נשמרה.
זוהו תאים סרטניים גדולים מרובי גרעינים ועלייה בכתם של סמן נזק לדנ"א בתאים סרטניים שטופלו ב-IR. כמו כן, זוהתה עלייה באסטרוציטים תגובתיים. האפופטוזיס הנגרם על ידי טיפול IR לא זוהה בפרוסות המוח של העכברים נטולי הגידולים.
פרוסות המוח המכילות גידולים טופלו בריכוזים שונים של פקליטקסל, תרופה כימותרפית. הטיפול הפחית את גודל הגידול באופן משמעותי לאחר יום 10 של הטיפול. עלייה באפופטוזיס זוהתה בתאי גידול שטופלו בפקליטקסל.
הטיפול במעכב לא שינה את הכדאיות של רקמת המוח. שום עלייה באפופטוזיס לא נמדדה על ידי צביעת קספאזה-3 מבוקעת בפרוסת מוח של עכברים שטופלו בפקליטקסל ללא גידולים. כאשר הטיפול בתרופות המעניינות הסתיים, ניתן לנתח פרוסות לביטוי חלבונים באמצעות אימונוציטוכימיה, מחקרים אומיים, או להשיג תרחיף חד-תאי המתאים לציטומטריה של זרימה.
