Questo protocollo consente la formazione di cellule tumorali metastatiche cerebrali e la generazione di fette di cervello ex vivo che consentono di testare rapidamente l'efficacia del farmaco e le radiazioni su un tumore preformato. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di testare rapidamente più farmaci o trattamenti in un ambiente fisiologicamente rilevante che mantiene le interazioni cervello-tumore-ospite. Questo metodo può aiutare a capire come le cellule metastatiche del cervello crescono, sopravvivono e invadono il parenchima cerebrale e comprendere il ruolo del microambiente tumorale cerebrale nella crescita e nella diffusione del cancro.
A dimostrare la procedura saranno Lorela Ciraku ed Emily Esquea, entrambe dottorande del mio laboratorio. Per iniziare, con posizionare i mouse anestetizzati in una cornice stereotassica e immobilizzare la testa usando le barre auricolari standard. Sterilizzare la superficie della testa tre volte mediante l'applicazione ripetuta alternata di tamponi di iodio e 70% di etanolo prima dell'incisione.
Usando un bisturi chirurgico, fai un'incisione della linea mediana di un centimetro con un angolo diagonale rispetto all'asse immaginario dividendo il cervello dei topi in due metà simmetriche per esporre il cranio. Dopo aver asciugato il sangue con un batuffolo di cotone, deviare la pelle lateralmente per esporre il sito di iniezione. Utilizzare una punta di bava da 0,73 millimetri per penetrare nel cranio e praticare un foro con una leggera pressione e movimento di torsione.
Per iniettare cinque microlitri di cellule che esprimono stabilmente la GFP luciferasi, inserire una siringa ad alta precisione a 3,5 millimetri di profondità nel cervello. Lasciare riposare per due minuti e poi tirare la siringa verso l'alto di circa un millimetro. Dopo due minuti, iniettare lentamente il primo mezzo volume e attendere altri due minuti prima di iniettare il resto del volume.
Dopo tre minuti, tirare lentamente la siringa. Applicare la cera ossea sul sito di iniezione sul cranio e suturare il tessuto con suture in polipropilene. Monitorare periodicamente il comportamento del topo subito dopo l'intervento chirurgico per determinare se sono necessari trattamenti speciali, tra cui iniezione salina e cibo morbido, per aiutare un rapido recupero.
Per monitorare la crescita del tumore tramite l'imaging a bioluminescenza, accendere prima l'ossigeno e l'isoflurano sul sistema di imaging e consentire che entrambi vengano distribuiti nella camera separata al di fuori della scatola di imaging. Quindi, dopo aver acceso il software e inizializzato lo strumento, scegliere l'opzione appropriata per visualizzare e catturare l'intero corpo del mouse. Quindi, trasferire i topi nella camera all'esterno della scatola di imaging fornita con ossigeno e isoflurano.
Una volta che i topi sono sotto l'effetto anestetico, iniettare i topi per via intraperitoneale con 200 microlitri di 30 milligrammi per millilitro di luciferina. Posizionare i topi nella camera di imaging con lo stomaco rivolto verso il basso verso il labbro del naso delle camere di imaging. Bloccare la camera, scegliere due minuti di esposizione per avviare l'imaging e quindi completare l'imaging.
Dopo aver posizionato l'affettatrice per tessuti in una cappa a flusso laminare sterile, pulire tutti gli strumenti e gli strumenti con etanolo al 70%. Dopo l'eutanasia del topo, rimuovere e posizionare rapidamente il cervello in una soluzione ghiacciata di saccarosio-ACSF. Usando una spatola, trasferire il cervello su una carta da filtro bagnata ACSF su un coperchio del piatto da 60 millimetri.
Usando una lama di rasoio affilata e sterile, taglia le parti in eccesso del cervello che non contengono alcun tumore, compresa la parte inferiore del cervello, per portare la forma del cervello a un cubo non perfetto. Dopo aver posizionato diversi fogli di carta da filtro bagnata ACSF sulla piattaforma di taglio, posizionare il tessuto bloccato sulla carta da filtro. Per affettare il tessuto in sezioni spesse da 200 a 250 micrometri, impostare la dimensione del taglio su 2 o 2,5 unità sul righello del fornitore e iniziare a tagliare.
Usa un pennello per trasferire le fette di cervello in un piatto contenente saccarosio-ACSF e separa le fette al microscopio ottico usando aghi calibro 27. Identificare le fette GFP-positive al microscopio fluorescente. Quindi, utilizzando una pipetta sterile rotta da un millilitro con un'ampia apertura, trasferire le fette identificate in un nuovo piatto da 60 millimetri contenente da due a tre millilitri di media a fette per adulti.
Quindi, trasferire da tre a cinque fette su ogni inserto di coltura tissutale in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti a distanza di sicurezza. Dopo aver rimosso il mezzo in eccesso dalla superficie dell'inserto, aggiungere un millilitro di mezzo di fetta di topo adulto equilibrato sotto ogni inserto. Incubare i tessuti a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità per 24 ore prima dell'imaging.
Pipettare cinque microlitri da 30 milligrammi per millilitro di soluzione di luciferina nel mezzo sotto gli inserti all'interno di un cappuccio sterile. Posizionare la piastra a sei pozzetti con il coperchio all'interno della camera di imaging dello strumento sotto la telecamera fissa e bloccare la porta della camera. Aprire il software e inizializzare lo strumento.
Dopo aver scelto le impostazioni della fotocamera che consentono la visualizzazione e l'acquisizione di un solo pozzo per immagine, posizionare il pozzo da visualizzare direttamente sotto la fotocamera. Usa lo strumento ROI, adattalo alla forma e alle dimensioni del tumore, misura il ROI e riporta le letture totali per quantificare il segnale bioluminescente di ciascun tumore sulla fetta. Dopo aver riportato la piastra alla cappa a flusso laminare sterile, utilizzare una pinza per sollevare leggermente l'inserto dal pozzo.
Dopo aver aspirato il mezzo, sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo fresco e riposizionare l'inserto nel pozzetto. Per gli esperimenti in cui le fette sono trattate con vari composti, come inibitori e metaboliti, preparare la concentrazione appropriata di reagente in 1,2 millilitri di mezzo di fetta di cervello in un tubo da 1,5 millilitri, quindi trasferire un millilitro di reagente al pozzo contenente la fetta. Le cellule di luciferasi MDA-MB-231 BR-GFP sono state iniettate in topi nudi, i tumori sono stati lasciati crescere, i cervelli con tumori sono stati sezionati, affettati, cresciuti ex vivo e la crescita del tumore è stata monitorata mediante imaging a bioluminescenza.
La colorazione H&E e la fluorescenza GFP-positiva hanno confermato la presenza di un tumore nella fetta di cervello. L'aumento della colorazione Ki-67 ha confermato la presenza di cellule tumorali altamente proliferative. I tumori nelle fette di cervello che non sono stati esposti all'irradiazione hanno continuato a crescere ex vivo, mentre i tumori esposti all'irradiazione hanno mostrato una crescita in stallo.
Le fette di cervello contenenti tumori sono state monitorate anche tramite imaging dal vivo per visualizzare la crescita del tumore dopo il trattamento di irradiazione. Coerentemente con l'imaging bioluminescente, le cellule tumorali di controllo sono cresciute rapidamente con l'aumentare dell'intensità della GFP e le cellule hanno iniziato a invadere il parenchima cerebrale. Al contrario, le cellule tumorali nelle fette di cervello trattate con irradiazione erano citostatiche e l'intensità della GFP è stata mantenuta.
Sono state rilevate grandi cellule tumorali multi-nucleate e un aumento della colorazione del marcatore di danno al DNA nelle cellule tumorali trattate con IR. Inoltre, è stato rilevato un aumento degli astrociti reattivi. L'apoptosi indotta dal trattamento IR non è stata rilevata nelle fette di cervello di topo prive di tumore.
Le fette di cervello contenenti tumori sono state trattate con diverse concentrazioni di paclitaxel, un farmaco chemioterapico. Il trattamento ha ridotto significativamente le dimensioni del tumore dopo il giorno 10 del trattamento. Un aumento dell'apoptosi è stato rilevato nelle cellule tumorali trattate con paclitaxel.
Il trattamento con inibitori non ha alterato la vitalità del tessuto cerebrale. Nessun aumento dell'apoptosi è stato misurato mediante colorazione di caspasi-3 scissa in fette di cervello di topo senza tumore trattate con paclitaxel. Quando il trattamento con i farmaci di interesse è terminato, le fette possono essere analizzate per l'espressione proteica attraverso immunocitochimica, studi omici o ottenere sospensioni unicellulari adatte alla citometria a flusso.
