Ce protocole permet la formation de cellules tumorales métastatiques cérébrales et la génération de tranches cérébrales ex vivo qui permettent de tester rapidement l’efficacité des médicaments et le rayonnement sur une tumeur préformée. Le principal avantage de cette technique est la possibilité de tester rapidement plusieurs médicaments ou traitements dans un cadre physiologiquement pertinent qui maintient les interactions cerveau-tumeur-hôte. Cette méthode peut aider à comprendre comment les cellules métastatiques du cerveau se développent, survivent et envahissent le parenchyme cérébral et à comprendre le rôle du microenvironnement de la tumeur cérébrale dans la croissance et la propagation du cancer.
Lorela Ciraku et Emily Esquea, toutes deux doctorantes de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, placez les souris anesthésiées dans un cadre stéréotaxique et immobilisez la tête à l’aide de barres d’oreille standard. Stériliser la surface de la tête trois fois en appliquant à plusieurs reprises des écouvillons d’iode et de l’éthanol à 70% avant l’incision.
À l’aide d’un scalpel chirurgical, faites une incision médiane d’un centimètre à un angle diagonal par rapport à l’axe imaginaire divisant le cerveau des souris en deux moitiés symétriques pour exposer le crâne. Après avoir essuyé tout sang avec un coton-tige, dévier la peau latéralement pour exposer le site d’injection. Utilisez un mèche de bavure de 0,73 millimètre pour pénétrer dans le crâne et percer un trou en utilisant une légère pression et un mouvement de torsion.
Pour injecter cinq microlitres de cellules exprimant de manière stable la luciférase GFP, insérez une seringue de haute précision à 3,5 millimètres de profondeur dans le cerveau. Laissez-le se déposer pendant deux minutes, puis tirez la seringue vers le haut d’environ un millimètre. Après deux minutes, injectez lentement le premier demi-volume et attendez encore deux minutes avant d’injecter le reste du volume.
Après trois minutes, tirez lentement la seringue. Appliquez de la cire osseuse sur le site d’injection sur le crâne et suturez le tissu avec des sutures en polypropylène. Surveillez périodiquement le comportement de la souris juste après la chirurgie pour déterminer si un traitement spécial, y compris l’injection de solution saline et les aliments mous, est nécessaire pour aider à une récupération rapide.
Pour surveiller la croissance tumorale via l’imagerie par bioluminescence, allumez d’abord l’oxygène et l’isoflurane sur le système d’imagerie et laissez les deux être distribués dans la chambre séparée à l’extérieur de la boîte d’imagerie. Ensuite, après avoir allumé le logiciel et initialisé l’instrument, choisissez l’option appropriée pour visualiser et capturer tout le corps de la souris. Ensuite, transférez les souris dans la chambre à l’extérieur de la boîte d’imagerie alimentée en oxygène et en isoflurane.
Une fois que les souris sont sous l’effet anesthésique, injectez aux souris par voie intrapéritonéale 200 microlitres de 30 milligrammes par millilitre de luciférine. Placez les souris dans la chambre d’imagerie avec l’estomac tourné vers le bas vers la lèvre nasale de la chambre d’imagerie. Verrouillez la chambre, choisissez une exposition de deux minutes pour démarrer l’imagerie, puis terminez l’imagerie.
Après avoir placé la trancheuse de tissu dans une hotte à flux laminaire stérile, nettoyez tous les outils et instruments avec de l’éthanol à 70%. Après avoir euthanasié la souris, retirez et placez rapidement le cerveau dans une solution glacée de saccharose-ACSF. À l’aide d’une spatule, transférez le cerveau sur un papier filtre mouillé par ACSF sur un couvercle de plat de 60 millimètres.
À l’aide d’une lame de rasoir tranchante et stérile, coupez les parties excédentaires du cerveau qui ne contiennent aucune tumeur, y compris la partie inférieure du cerveau, pour amener la forme du cerveau à un cube non parfait. Après avoir placé plusieurs feuilles de papier filtre mouillé par ACSF sur la plate-forme de coupe, placez le tissu bloqué sur le papier filtre. Pour découper le tissu en sections de 200 à 250 micromètres d’épaisseur, réglez la taille de coupe sur 2 ou 2,5 unités sur la règle du fournisseur et commencez à couper.
Utilisez un pinceau pour transférer des tranches de cerveau dans un plat contenant du saccharose-ACSF et séparez les tranches sous un microscope optique à l’aide d’aiguilles de calibre 27. Identifiez les tranches GFP positives au microscope fluorescent. Ensuite, à l’aide d’une pipette stérile d’un millilitre cassée avec une large ouverture, transférez les tranches identifiées dans un nouveau plat de 60 millimètres contenant deux à trois millilitres de milieux de tranches adultes.
Ensuite, transférez trois à cinq tranches sur chaque insert de culture tissulaire dans chaque puits d’une plaque de six puits à une distance de sécurité. Après avoir retiré l’excès de milieu de la surface de l’insert, ajoutez un millilitre de milieu de tranche de souris adulte équilibré sous chaque insert. Incuber les tissus à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité pendant 24 heures avant l’imagerie.
Pipeter cinq microlitres de 30 milligrammes par millilitre de solution de luciférine dans le milieu sous les inserts à l’intérieur d’une hotte stérile. Placez la plaque à six puits avec le couvercle à l’intérieur de la chambre d’imagerie de l’instrument sous la caméra fixe et verrouillez la porte de la chambre. Ouvrez le logiciel et initialisez l’instrument.
Après avoir choisi les paramètres de l’appareil photo permettant la visualisation et la capture d’un seul puits par image, placez le puits à imager directement sous l’appareil photo. Utilisez l’outil ROI, ajustez-le autour de la forme et de la taille de la tumeur, mesurez le retour sur investissement et rapportez les lectures totales pour quantifier le signal bioluminescent de chaque tumeur sur la tranche. Après avoir ramené la plaque à la hotte à écoulement laminaire stérile, utilisez une pince pour soulever légèrement l’insert du puits.
Après avoir aspiré le milieu, remplacez-le par un millilitre de milieu frais et replacez l’encart dans le puits. Pour les expériences où les tranches sont traitées avec divers composés, tels que des inhibiteurs et des métabolites, préparer la concentration appropriée de réactif dans 1,2 millilitre de milieu de tranche cérébrale dans un tube de 1,5 millilitre, puis transférer un millilitre de réactif au puits contenant la tranche. Les cellules luciférases MDA-MB-231 BR-GFP ont été injectées à des souris nues, les tumeurs ont été autorisées à se développer, les cerveaux avec des tumeurs ont été disséqués, tranchés, cultivés ex vivo et la croissance tumorale a été surveillée par imagerie par bioluminescence.
La coloration H&E et la fluorescence GFP-positive ont confirmé la présence d’une tumeur dans la tranche de cerveau. L’augmentation de la coloration Ki-67 a confirmé la présence de cellules cancéreuses hautement prolifératives. Les tumeurs dans les tranches de cerveau qui n’ont pas été exposées à l’irradiation ont continué à croître ex vivo, tandis que les tumeurs exposées à l’irradiation ont montré une croissance bloquée.
Les tranches de cerveau contenant des tumeurs ont également été surveillées via l’imagerie en direct pour visualiser la croissance tumorale après le traitement d’irradiation. Conformément à l’imagerie bioluminescente, les cellules cancéreuses de contrôle se sont rapidement développées à mesure que l’intensité du GFP augmentait et que les cellules commençaient à envahir le parenchyme cérébral. En revanche, les cellules cancéreuses dans les tranches de cerveau traitées par irradiation étaient cytostatiques et l’intensité de la GFP était maintenue.
De grandes cellules cancéreuses multinucléées et une augmentation de la coloration du marqueur de dommages à l’ADN dans les cellules cancéreuses traitées par IR ont été détectées. En outre, une augmentation des astrocytes réactifs a été détectée. L’apoptose induite par le traitement IR n’a pas été détectée dans les tranches de cerveau de souris sans tumeur.
Les tranches de cerveau contenant des tumeurs ont été traitées avec différentes concentrations de paclitaxel, un médicament chimiothérapeutique. Le traitement a considérablement diminué la taille de la tumeur après le jour 10 du traitement. Une augmentation de l’apoptose a été détectée dans les cellules tumorales traitées au paclitaxel.
Le traitement par inhibiteur n’a pas altéré la viabilité des tissus cérébraux. Aucune augmentation de l’apoptose n’a été mesurée par coloration à la caspase-3 clivée dans une tranche de cerveau de souris sans tumeur traitée au paclitaxel. Lorsque le traitement avec les médicaments d’intérêt est terminé, les tranches peuvent être analysées pour l’expression des protéines par immunocytochimie, études omiques, ou obtenir une suspension unicellulaire adaptée à la cytométrie en flux.
