يصف هذا البروتوكول طريقة تمكن من تحديد موقع معين لبقايا السيستين المؤكسدة للبروتينات. تسمح هذه الطريقة بتوليد بيانات كمية ومحددة الموقع لبقايا السيستين المؤكسدة من أنواع مختلفة من العينات. لبدء إجراء الالتقاط المساعد ، اغسل كريات البروتين المترسبة مرتين باستخدام الأسيتون عن طريق الطرد المركزي عند 20،500 جم ، في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم صب الأسيتون وإزالة الأسيتون المتبقي مع ماصة صغيرة. باستخدام ماصة مصلية زجاجية ، أضف ثلاثة ملليلتر من الأسيتون البارد المثلج الطازج إلى الأنبوب واخلطه جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. بعد الغسيل الثاني ، اترك الكريات تجف في الهواء لمدة دقيقة إلى دقيقتين دون تركها تجف.
أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت B إلى حبيبات البروتين المجففة. لإذابة البروتين ، صوتنة الحبيبات بشكل متكرر في سونيكاتور الحمام بإخراج 250 واط لمدة 15 إلى 30 ثانية في المرة الواحدة ، جنبا إلى جنب مع دوامة قصيرة. قم بإجراء فحص حمض Bicinchoninic أو BCA لقياس تركيز البروتين.
لتوحيد تركيزات البروتين ، انقل 500 ميكروغرام من عينة البروتين إلى مرشح طرد مركزي 0.5 ملليلتر ، 10 كيلودالتون ، وقم بزيادة حجم العينة إلى 500 ميكرولتر مع مخزن مؤقت لإعادة التعليق. الطرد المركزي خليط عازلة البروتين في 14،000 غرام في درجة حرارة الغرفة ، حتى الحجم في مرشح الطرد المركزي أقل من 100 ميكرولتر. اجمع العينة عن طريق قلب المرشح في أنبوب تجميع.
قم بالطرد المركزي للعينة عند 1000 G لمدة دقيقتين وأضف المخزن المؤقت C للحصول على حجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر. لتقليل ثيول البروتين ، أضف 20 ميكرولتر من 500 ملليمولار ديثيوثريتول أو DTT ، إلى العينة للحصول على تركيز نهائي قدره 20 ملي مولار ، واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة. بعد التخفيض ، يتم الطرد المركزي للعينات إلى مرشحات طرد مركزي 0.5 ملليلتر 10 كيلودالتون عند 14،000 G في درجة حرارة الغرفة ، حتى يكون الحجم في مرشح الطرد المركزي أقل من 100 ميكرولتر.
أضف المخزن المؤقت D لتعويض الحجم إلى 500 ميكرولتر وكرر الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي الرابع ، اجمع العينات عن طريق قلب المرشح في أنبوب تجميع إلى جهاز طرد مركزي عند 1000 جم لمدة دقيقتين. ثم قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة BCA.
بعد ذلك ، ضع أعمدة الدوران على مشعب فراغ ، وباستخدام ماصة صغيرة ، قم بنقل 500 ميكرولتر من ملاط راتنج تقارب الثيول الطازج إلى كل عمود. تطبيق فراغ لإزالة الماء. كرر الإجراء مرة واحدة للحصول على 30 ملليغرام من الراتنج لكل عمود.
اغسل الراتنج خمس مرات ب 500 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، عن طريق وضع فراغ لإزالة الماء ثم خمس مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت E.In أنبوب جديد ، أضف المخزن المؤقت C إلى 150 ميكروغرام من عينة البروتين المختزلة حتى يصبح الحجم النهائي 120 ميكرولتر. انقل محلول البروتين إلى عمود دوران موصول يحتوي على الراتنج. ضع الغطاء على العمود واحتضانه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.
اغسل الراتنج كما هو موضح في المخطوطة. استبدل القابس. لإجراء عملية الهضم التربتيك على الراتنج ، أضف 120 ميكرولترا من محلول التربسين الطازج إلى العينات ، واحتضن العمود طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.
في اليوم التالي ، اغسل الراتنج عدة مرات كما هو موضح في المخطوطة واستبدل القابس. باستخدام ماصة صغيرة ، أضف 40 ميكرولتر من 100 مليمولار ثلاثي إيثيل أمونيوم بيكربونات عازلة إلى الراتنج المغسول. ثم أضف 70 ميكرولتر من علامة الكتلة الترادفية الذائبة أو كاشف وضع العلامات TMT ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز عند 850 دورة في الدقيقة.
قم بتخزين أي كاشف TMT متبقي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. اغسل الراتنج واستبدل القابس. قم بتخفيف الببتيدات المسماة TMT بإضافة 100 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم 100 مللي مولار عند الرقم الهيدروجيني 8.0 ، الذي يحتوي على 20 ملليمولار DTT ، إلى العمود ، واحتضان العمود على خلاط حراري في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة عند 850 دورة في الدقيقة.
بعد الحضانة ، قم بإجراء الشطف عن طريق وضع العمود على مشعب فراغ ، وتطبيق الفراغ وتفريغ العينات في أنبوب طرد مركزي صغير سعة خمسة ملليلتر. كرر الخطوة مرة واحدة ، ثم أضف 100 ميكرولتر من 80٪ أسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك إلى العمود. بعد احتضان العمود لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بإخراج العينة في نفس أنبوب الطرد المركزي سعة خمسة ملليلتر.
ضع العينات المستخلصة في مكثف فراغ حتى تجف. ثم قم بتخزين الببتيدات الجافة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم استخدامها مرة أخرى. تم إجراء التحليل النوعي لعينات الببتيد من خلايا RAW 264.7 باستخدام SDS-PAGE ، حيث تمت مقارنة العينات من خلال تحديد مستويات مختلفة من الأكسدة بسبب العلاجات.
تم فحص البروتينات المنفصلة لاحقا بواسطة Western Blot لمزيد من التحقيق في مستويات أكسدة البروتينات الفردية. تم تحليل كثافة الأيونات المبلغ عنها للسيستين المحتوي على الببتيدات بواسطة مطياف الكتلة الترادفي اللوني السائل. تم تحديد القياس الكيميائي لأكسدة الثيول ل iTRAQ ، المسمى الببتيدات المخصبة والمؤكسدة على مستويات موقع السيستين الفردية.
قم بإزالة الأسيتون بعناية دون إزعاج حبيبات البروتين. تأكد من أن حبيبات البروتين قابلة للذوبان تماما ومحددة كميا بدقة, وأن الراتنج مخصص بدقة لأعمدة الدوران. تأكد من إعادة تعليق الراتنج أثناء خطوات الغسيل.
يمكن إجراء مزيد من التقييم للبروتينات والببتيدات المخصبة بواسطة SDS-PAGE والتلوين والنشاف الغربي وقياس الطيف الكتلي.
