이 프로토콜은 단백질의 산화된 시스틴 잔기의 부위 특이적 식별을 가능하게 하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 산화된 시스틴 잔기의 정량적 및 부위별 데이터를 다양한 샘플 유형에서 생성할 수 있습니다. 보조 포획 절차를 시작하려면 침전 된 단백질 펠릿을 섭씨 4도에서 섭씨 4도에서 20, 500G에서 10 분 동안 원심 분리하여 아세톤으로 두 번 세척하십시오.
그런 다음 아세톤을 따라 내고 마이크로 피펫으로 남은 아세톤을 제거합니다. 유리 혈청 피펫을 사용하여 3 밀리리터의 신선한 얼음처럼 차가운 아세톤을 튜브에 넣고 튜브를 여러 번 뒤집어 잘 섞습니다. 두 번째 세척 후 펠릿을 과도하게 건조시키지 않고 1-2분 동안 자연 건조시키십시오.
건조된 단백질 펠릿에 완충액 B 1밀리리터를 첨가한다. 단백질을 용해하려면 간단한 소용돌이와 함께 한 번에 15-30 초 동안 250 와트의 출력을 가진 목욕 초음파 처리기에서 펠렛을 반복적으로 초음파 처리합니다. 비신코닌산 또는 BCA 분석을 수행하여 단백질 농도를 측정하였다.
단백질 농도를 표준화하려면 500마이크로그램의 단백질 샘플을 0.5밀리리터, 10킬로달톤 원심 필터로 옮기고 재현탁 버퍼를 사용하여 샘플을 500마이크로리터로 부피를 늘립니다. 단백질 완충액 혼합물을 실온에서 14, 000 G에서, 원심분리 필터의 부피가 100 마이크로리터 미만이 될 때까지 원심분리한다. 수집 튜브에서 필터를 뒤집어 샘플을 수집합니다.
샘플을 1000G에서 2분 동안 원심분리하고 완충액 C를 추가하여 500마이크로리터의 최종 부피를 얻습니다. 단백질 티올을 줄이려면 20 마이크로 리터의 500 밀리몰 디티 오 트레이 톨 또는 DTT를 샘플에 첨가하여 20 밀리몰의 최종 농도를 얻고 30 RPM에서 흔들면서 섭씨 37도에서 850 분 동안 샘플을 배양합니다. 환원 후, 원심 필터의 부피가 100 마이크로 리터 미만이 될 때까지 실온에서 14, 000 G에서 0.5 밀리리터 10 킬로 달톤 원심 필터로 샘플을 원심 분리합니다.
버퍼 D를 추가하여 부피를 500 마이크로 리터로 구성하고 원심 분리를 반복하십시오. 4차 원심분리 후, 수집 튜브에서 필터를 1000 G에서 2분 동안 원심분리하여 반전시켜 샘플을 수집한다. 그런 다음 BCA 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
다음으로, 스핀 컬럼을 진공 매니폴드 상에 놓고, 마이크로 피펫을 사용하여 새로 제조된 티올 친화성 수지 슬러리 500 마이크로리터를 각 컬럼으로 옮긴다. 물을 제거하기 위해 진공을 적용하십시오. 이 절차를 한 번 반복하여 컬럼 당 30 밀리그램의 수지를 얻습니다.
수지를 500 마이크로리터의 초순수로 5회 세척하고, 진공을 가하여 물을 제거한 다음, 500 마이크로리터의 완충액으로 5회 E.In 새로운 튜브를 가하고, 최종 부피가 120 마이크로리터가 될 때까지 감소된 단백질 샘플 150 마이크로그램에 완충액 C를 첨가한다. 단백질 용액을 수지를 함유하는 막힌 스핀 컬럼으로 옮긴다. 컬럼에 캡을 놓고 850rpm으로 흔들면서 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
원고에 설명 된대로 수지를 씻으십시오. 플러그를 교체하십시오. 레진 상의 트립신 분해를 수행하려면 120마이크로리터의 새로 준비된 트립신 용액을 샘플에 추가하고 850RPM으로 흔들면서 섭씨 37도에서 밤새 컬럼을 배양합니다.
다음날, 원고에 설명 된대로 수지를 여러 번 씻고 플러그를 교체하십시오. 마이크로 피펫을 사용하여 40 마이크로리터의 100 밀리몰 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액을 세척된 수지에 첨가합니다. 이어서, 70 마이크로리터의 용해된 탠덤 질량 태그 또는 TMT 표지 시약을 첨가하고, 850 RPM에서 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
남은 TMT 시약은 영하 80도에서 보관하십시오. 수지를 씻고 플러그를 교체하십시오. 20 밀리몰 DTT를 함유하는 pH 8.0에서 100 마이크로리터의 100 마이크로몰 암모늄 중탄산염 완충액을 컬럼에 첨가하여 TMT 표지된 펩티드를 용리시키고, 850 RPM에서 30분 동안 실온에서 열 혼합기에서 컬럼을 인큐베이션한다.
배양 후 컬럼을 진공 매니폴드에 놓고 진공을 적용하고 샘플을 5밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 용리하여 용리를 수행합니다. 단계를 한 번 반복한 다음 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 100마이크로리터의 80% 아세토니트릴을 컬럼에 추가합니다. 컬럼을 실온에서 10분 동안 배양한 후, 동일한 5밀리리터 원심분리 튜브에서 샘플을 용출시킨다.
용리된 샘플을 건조될 때까지 진공 농축기에 넣습니다. 그런 다음 추가 사용이 될 때까지 건조 펩타이드를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. RAW 264.7 세포로부터의 펩티드 샘플의 정성 분석은 SDS-PAGE로 수행되었으며, 여기서 샘플은 처리로 인한 상이한 산화 수준을 결정함으로써 비교되었다.
분리된 단백질을 웨스턴 블롯으로 이어서 프로빙하여 개별 단백질의 산화 수준을 추가로 조사했습니다. 시스틴 함유 펩티드의 보고된 이온 강도는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광분석법에 의해 분석되었다. iTRAQ의 티올 산화 화학량론을 개별 시스틴 부위 수준에서 농축 및 산화된 펩타이드로 표지하여 정량화하였다.
단백질 펠릿을 방해하지 않고 조심스럽게 아세톤을 제거하십시오. 단백질 펠릿이 완전히 용해되고 정밀하게 정량되고 수지가 스핀 컬럼에 정확하게 할당되었는지 확인합니다. 세척 단계에서 레진을 다시 현탁하십시오.
농축된 단백질 및 펩티드의 추가의 평가는 SDS-PAGE 염색, 웨스턴 블롯팅 및 질량 분광분석법에 의해 수행될 수 있다.
