Este protocolo descreve um método que permite a identificação sítio-específica de resíduos de cistina oxidada de proteínas. O método permite que dados quantitativos e site-specific de resíduos de cistina oxidada sejam gerados a partir de vários tipos de amostras. Para iniciar o procedimento de captura assistida, lave os pellets de proteína precipitada duas vezes com acetona por centrifugação a 20, 500 G, em quatro graus Celsius por 10 minutos.
Em seguida, decante a acetona e remova a acetona restante com uma micropipeta. Usando uma pipeta sorológica de vidro, adicione três mililitros de acetona gelada fresca ao tubo e misture bem invertendo o tubo várias vezes. Após a segunda lavagem, deixe os pellets secarem ao ar por um a dois minutos sem deixá-los secar demais.
Adicione um mililitro de tampão B ao pellet de proteína seca. Para solubilizar a proteína, sonicate o pellet repetidamente em um sonicator de banho com uma saída de 250 watts por 15 a 30 segundos de cada vez, juntamente com um breve vórtice. Realize o ensaio de ácido bicinchonínico ou BCA para medir a concentração de proteína.
Para padronizar as concentrações de proteína, transfira 500 microgramas de amostra de proteína para um filtro centrífugo de 0,5 mililitro e 10 quilodaltons e aumente o volume da amostra para 500 microlitros com tampão de ressuspensão. Centrifugar a mistura tampão proteico a 14 000 G à temperatura ambiente, até que o volume no filtro centrífugo seja inferior a 100 microlitros. Recolha a amostra invertendo o filtro num tubo de recolha.
Centrifugar a amostra a 1000 G durante dois minutos e adicionar tampão C para obter um volume final de 500 microlitros. Para reduzir os tióis de proteína, adicione 20 microlitros de 500 milimolares de ditiotreitol ou TDT, à amostra para obter uma concentração final de 20 milimolares e incube as amostras por 30 minutos a 37 graus Celsius com agitação a 850 RPM. Após redução, centrifugar para as amostras em filtros centrífugos de 0,5 mililitros e 10 quilodalton a 14.000 G à temperatura ambiente, até que o volume no filtro centrífugo seja inferior a 100 microlitros.
Adicione o tampão D para compor o volume a 500 microlitros e repita a centrifugação. Após a quarta centrifugação, recolher as amostras invertendo o filtro num tubo de recolha para centrifugar a 1000 G durante dois minutos. Em seguida, meça a concentração de proteína usando o ensaio de BCA.
Em seguida, coloque as colunas de rotação em um coletor de vácuo e, usando uma micropipeta, transfira 500 microlitros da pasta de resina de afinidade de tiol recém-preparada para cada coluna. Aplique vácuo para remoção de água. Repita o procedimento uma vez para obter 30 miligramas de resina por coluna.
Lave a resina cinco vezes com 500 microlitros de água ultrapura, aplicando um vácuo para remover a água e, em seguida, cinco vezes com 500 microlitros de tampão E.In um novo tubo, adicione o tampão C a 150 microgramas da amostra de proteína reduzida até que o volume final seja de 120 microlitros. Transfira a solução proteica para uma coluna de rotação conectada contendo a resina. Coloque a tampa na coluna e incube durante duas horas à temperatura ambiente com agitação a 850 rpm.
Lave a resina conforme descrito no manuscrito. Substitua o plugue. Para realizar a digestão tríptica em resina, adicione 120 microlitros de solução de tripsina recém-preparada às amostras e incube a coluna durante a noite a 37 graus Celsius, com agitação a 850 RPM.
No dia seguinte, lave a resina várias vezes, conforme descrito no manuscrito, e substitua o plugue. Usando uma micropipeta, adicione 40 microlitros de tampão de bicarbonato de trietilamônio 100 milimolares à resina lavada. Em seguida, adicione 70 microlitros da etiqueta de massa em tandem dissolvido ou do reagente de marcação TMT e incube por uma hora à temperatura ambiente com agitação a 850 RPM.
Armazene qualquer reagente TMT restante a menos 80 graus Celsius. Lave a resina e substitua o plugue. Eluir os peptídeos marcados com TMT adicionando 100 microlitros de tampão de bicarbonato de amônio 100 milimolares a pH 8,0, contendo 20 milimolares de TDT, à coluna e incubando a coluna em um misturador térmico à temperatura ambiente por 30 minutos a 850 RPM.
Após a incubação, realize a eluição colocando a coluna em um coletor de vácuo, aplicando o vácuo e eluíndo as amostras em um tubo de microcentrífuga de cinco mililitros. Repita o passo uma vez e, em seguida, adicione 100 microlitros de acetonitrila a 80% com ácido trifluoroacético a 0,1% à coluna. Depois de incubar a coluna durante 10 minutos à temperatura ambiente, eluir a amostra no mesmo tubo de centrífuga de cinco mililitros.
Colocar as amostras eluídas num concentrador de vácuo até secar. Em seguida, armazene os peptídeos secos a menos 80 graus Celsius até o uso posterior. A análise qualitativa de amostras peptídicas de células RAW 264.7 foi realizada com SDS-PAGE, em que as amostras foram comparadas determinando-se diferentes níveis de oxidação devido aos tratamentos.
As proteínas separadas foram posteriormente sondadas por western blot para investigar melhor os níveis de oxidação de proteínas individuais. As intensidades de íons relatadas de peptídeos contendo cistina foram analisadas por espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida. A estequiometria de oxidação do tiol do iTRAQ, peptídeos enriquecidos e oxidados marcados em níveis individuais de cistina foram quantificados.
Remova cuidadosamente a acetona sem perturbar o pellet de proteína. Certifique-se de que o pellet de proteína seja completamente solubilizado e quantificado com precisão, e que a resina seja alocada com precisão nas colunas de spin. Certifique-se de ressuspender novamente a resina durante as etapas de lavagem.
Uma avaliação adicional de proteínas e peptídeos enriquecidos pode ser realizada por SDS-PAGE e coloração, western blotting e espectrometria de massa.
