Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die eine ortsspezifische Identifizierung von oxidierten Cystinresten von Proteinen ermöglicht. Die Methode ermöglicht es, quantitative und standortspezifische Daten von oxidierten Cystinresten aus verschiedenen Probentypen zu generieren. Um das unterstützte Abscheidungsverfahren zu beginnen, waschen Sie die gefällten Proteinpellets zweimal mit Aceton, indem Sie bei 20, 500 G, bei vier Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren.
Dekantieren Sie dann das Aceton und entfernen Sie das restliche Aceton mit einer Mikropipette. Mit einer serologischen Glaspipette drei Milliliter frisches eiskaltes Aceton in die Tube geben und gut mischen, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen. Lassen Sie die Pellets nach der zweiten Wäsche ein bis zwei Minuten an der Luft trocknen, ohne sie übertrocknen zu lassen.
Fügen Sie dem getrockneten Proteinpellet einen Milliliter Puffer B hinzu. Um das Protein zu lösen, beschallen Sie das Pellet wiederholt in einem Badesonikator mit einer Leistung von 250 Watt für jeweils 15 bis 30 Sekunden zusammen mit kurzem Wirbeln. Führen Sie den Bicinchoninsäure- oder BCA-Assay durch, um die Proteinkonzentration zu messen.
Um die Proteinkonzentrationen zu standardisieren, werden 500 Mikrogramm Proteinprobe in einen 0,5 Milliliter, 10 Kilodalton Zentrifugalfilter überführt und die Probe mit Resuspensionspuffer auf 500 Mikroliter erhöht. Zentrifugieren Sie die Proteinpuffermischung bei 14.000 G bei Raumtemperatur, bis das Volumen im Zentrifugalfilter weniger als 100 Mikroliter beträgt. Sammeln Sie die Probe, indem Sie den Filter in einem Sammelröhrchen umdrehen.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 G für zwei Minuten und fügen Sie Puffer C hinzu, um ein Endvolumen von 500 Mikrolitern zu erhalten. Um die Proteinthiole zu reduzieren, fügen Sie 20 Mikroliter 500 Millimolar Dithiothreitol oder DTT in die Probe hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Millimolar zu erhalten, und inkubieren Sie die Proben für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 850 U / min. Nach der Reduktion werden die Proben in 0,5 Milliliter 10 Kilodalton Zentrifugalfilter bei 14.000 G bei Raumtemperatur zentrifugiert, bis das Volumen im Zentrifugalfilter weniger als 100 Mikroliter beträgt.
Fügen Sie den Puffer D hinzu, um das Volumen auf 500 Mikroliter zu erhöhen, und wiederholen Sie die Zentrifugation. Nach der vierten Zentrifugation sammeln Sie die Proben, indem Sie den Filter in einem Sammelröhrchen umdrehen, um zwei Minuten lang bei 1000 G zu zentrifugieren. Messen Sie dann die Proteinkonzentration mit dem BCA-Assay.
Als nächstes legen Sie die Spinsäulen auf einen Vakuumverteiler und übertragen mit einer Mikropipette 500 Mikroliter der frisch zubereiteten Thiol-Affinitätsharzaufschlämmung auf jede Säule. Wenden Sie Vakuum an, um Wasser zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang einmal, um 30 Milligramm Harz pro Säule zu erhalten.
Waschen Sie das Harz fünfmal mit 500 Mikrolitern Reinstwasser, indem Sie ein Vakuum anwenden, um das Wasser zu entfernen, und dann fünfmal mit 500 Mikrolitern Puffer E.In einem neuen Röhrchen, fügen Sie Puffer C zu 150 Mikrogramm der reduzierten Proteinprobe hinzu, bis das endgültige Volumen 120 Mikroliter beträgt. Übertragen Sie die Proteinlösung in eine verstopfte Spinsäule, die das Harz enthält. Setzen Sie die Kappe auf die Säule und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur mit Schütteln bei 850 U/min.
Waschen Sie das Harz wie im Manuskript beschrieben. Ersetzen Sie den Stecker (plug). Um einen tryptischen Aufschluss auf Harz durchzuführen, fügen Sie den Proben 120 Mikroliter frisch zubereitete Trypsinlösung hinzu und inkubieren Sie die Säule über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 850 U/min.
Am nächsten Tag waschen Sie das Harz mehrmals, wie im Manuskript beschrieben, und ersetzen Sie den Stopfen. Mit einer Mikropipette 40 Mikroliter 100 Millimolar Triethylammoniumbicarbonatpuffer in das gewaschene Harz geben. Dann fügen Sie 70 Mikroliter des gelösten Tandem-Massenetiketts oder TMT-Etikettierreagenz hinzu und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 850 U/min.
Lagern Sie das restliche TMT-Reagenz bei minus 80 Grad Celsius. Waschen Sie das Harz und setzen Sie den Stopfen wieder ein. Eluieren Sie die TMT-markierten Peptide, indem Sie 100 Mikroliter 100 Millimolar Ammoniumbicarbonatpuffer bei pH 8,0, der 20 Millimolar DTT enthalten, in die Säule geben und die Säule auf einem thermischen Mischer bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 850 U/min inkubieren.
Führen Sie nach der Inkubation eine Elution durch, indem Sie die Säule auf einen Vakuumverteiler legen, das Vakuum anwenden und die Proben in ein Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen eluieren. Wiederholen Sie den Schritt einmal und fügen Sie dann 100 Mikroliter 80% Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure in die Säule ein. Nach 10-minütiger Inkubation der Säule bei Raumtemperatur eluieren Sie die Probe im selben Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Legen Sie die eluierten Proben in einen Vakuumkonzentrator, bis sie trocken sind. Anschließend lagern Sie die trockenen Peptide bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius. Die qualitative Analyse von Peptidproben aus RAW 264.7 Zellen wurde mit SDS-PAGE durchgeführt, wobei Proben durch Bestimmung verschiedener Oxidationsgrade aufgrund von Behandlungen verglichen wurden.
Die getrennten Proteine wurden anschließend mit Western Blot untersucht, um die Oxidationsgrade einzelner Proteine weiter zu untersuchen. Die berichteten Ionenintensitäten von cystinhaltigen Peptiden wurden mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Thioloxidationsstöchiometrie von iTRAQ markierte angereicherte und oxidierte Peptide auf einzelnen Cystinstellenebenen wurden quantifiziert.
Entfernen Sie vorsichtig Aceton, ohne das Proteinpellet zu stören. Stellen Sie sicher, dass das Proteinpellet vollständig löslich und präzise quantifiziert ist und dass das Harz den Spinsäulen genau zugeordnet ist. Achten Sie darauf, Harz während der Waschschritte zu resuspendieren.
Die weitere Bewertung von angereicherten Proteinen und Peptiden kann durch SDS-PAGE und Färbung, Western Blotting und Massenspektrometrie erfolgen.
