Bu protokol, proteinlerin oksitlenmiş sistin kalıntılarının bölgeye özgü olarak tanımlanmasını sağlayan bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, oksitlenmiş sistin kalıntılarının kantitatif ve bölgeye özgü verilerinin çeşitli numune tiplerinden üretilmesini sağlar. Yardımlı yakalama prosedürüne başlamak için, çökeltilmiş protein peletlerini 10 dakika boyunca dört santigrat derece içinde 20.500 G'de santrifüj yaparak asetonla iki kez yıkayın.
Daha sonra asetonu boşaltın ve kalan asetonu bir mikro pipetle çıkarın. Bir cam serolojik pipet kullanarak tüpe üç mililitre taze buz gibi soğuk aseton ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. İkinci yıkamadan sonra, peletlerin kurumasına izin vermeden bir ila iki dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin.
Kurutulmuş protein peletine bir mililitre tampon B ekleyin. Proteini çözündürmek için, peleti bir seferde 15 ila 30 saniye boyunca 250 watt'lık bir çıkışa sahip bir banyo sonikatöründe tekrar tekrar sonikleştirin, kısa girdapla birlikte. Protein konsantrasyonunu ölçmek için Bicinchoninic asit veya BCA testini yapın.
Protein konsantrasyonlarını standartlaştırmak için, 500 mikrogram protein örneğini 0,5 mililitre, 10 kilodalton santrifüj filtreye aktarın ve numuneyi ressüspansiyon tamponu ile 500 mikrolitreye çıkarın. Protein tampon karışımını, santrifüj filtredeki hacim 100 mikrolitreden az olana kadar oda sıcaklığında 14.000 G'de santrifüj yapın. Bir toplama tüpündeki filtreyi ters çevirerek numuneyi toplayın.
Numuneyi iki dakika boyunca 1000 G'de santrifüj edin ve 500 mikrolitrelik son bir hacim elde etmek için C tamponunu ekleyin. Protein tiollerini azaltmak için, 20 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için numuneye 20 mikrolitre 500 milimolar dithiothreitol veya DTT ekleyin ve numuneleri 850 RPM'de sallayarak 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İndirgemeden sonra, santrifüj filtresindeki hacim 100 mikrolitreden az olana kadar, numunelere oda sıcaklığında 14.000 G'de 0,5 mililitre 10 kilodalton santrifüj filtrelere santrifüj yapın.
Hacmi 500 mikrolitreye çıkarmak için tampon D ekleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Dördüncü santrifüjlemeden sonra, iki dakika boyunca 1000 G'de santrifüj yapmak için filtreyi bir toplama tüpünde ters çevirerek numuneleri toplayın. Daha sonra BCA testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
Daha sonra, sıkma kolonlarını bir vakum manifolduna yerleştirin ve bir mikro pipet kullanarak, taze hazırlanmış tiol afiniteli reçine bulamacının 500 mikrolitresini her bir kolona aktarın. Suyun uzaklaştırılması için vakum uygulayın. Sütun başına 30 miligram reçine elde etmek için prosedürü bir kez tekrarlayın.
Reçineyi beş kez 500 mikrolitre ultra saf su ile yıkayın, suyu çıkarmak için bir vakum uygulayarak ve daha sonra yeni bir tüp E.In 500 mikrolitre tamponla beş kez yıkayın, son hacim 120 mikrolitre olana kadar indirgenmiş protein numunesinin 150 mikrogramına C tamponu ekleyin. Protein çözeltisini, reçineyi içeren tıkanmış bir spin kolonuna aktarın. Kapağı kolona yerleştirin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca 850 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
Reçineyi makalede açıklandığı gibi yıkayın. Fişi değiştirin. Reçine üzerinde triptik sindirim gerçekleştirmek için, numunelere 120 mikrolitre taze hazırlanmış tripsin çözeltisi ekleyin ve kolonu gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, 850 RPM'de çalkalayın.
Ertesi gün, reçineyi makalede açıklandığı gibi birkaç kez yıkayın ve fişi değiştirin. Bir mikro pipet kullanarak, yıkanmış reçineye 40 mikrolitre 100 milimolar Trietilammonyum bikarbonat tamponu ekleyin. Daha sonra 70 mikrolitre çözünmüş tandem kütle etiketi veya TMT etiketleme reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında 850 RPM'de çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin.
Kalan TMT reaktifini eksi 80 santigrat derecede saklayın. Reçineyi yıkayın ve fişi değiştirin. TMT etiketli peptitleri, pH 8.0'da 20 milimolar DTT içeren pH 8.0'da 100 mikrolitre 100 milimolar amonyum bikarbonat tamponu ekleyerek ve kolonu oda sıcaklığında bir termal karıştırıcı üzerinde 850 RPM'de 30 dakika boyunca inkübe ederek etkisiz hale getirin.
Kuluçkadan sonra, sütunu bir vakum manifolduna yerleştirerek, vakumu uygulayarak ve numuneleri beş mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne boşaltarak elüsyon gerçekleştirin. Adımı bir kez tekrarlayın, ardından kolona% 0.1 trifloroasetik asit ile% 80 asetonitril 100 mikrolitre ekleyin. Kolonu oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, numuneyi aynı beş mililitrelik santrifüj tüpünde süzün.
Salınan numuneleri kuruyana kadar bir vakum yoğunlaştırıcısına yerleştirin. Daha sonra kuru peptitleri daha fazla kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. RAW 264.7 hücrelerinden alınan peptit örneklerinin kalitatif analizi, SDS-PAGE ile gerçekleştirilmiştir, burada örnekler, tedavilere bağlı farklı oksidasyon seviyeleri belirlenerek karşılaştırılmıştır.
Ayrılan proteinler daha sonra, bireysel proteinlerin oksidasyon seviyelerini daha fazla araştırmak için batı lekesi tarafından araştırıldı. Sistin içeren peptitlerin bildirilen iyon yoğunlukları sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi ile analiz edildi. Bireysel sistin bölgesi seviyelerinde zenginleştirilmiş ve oksitlenmiş peptitler olarak etiketlenmiş iTRAQ'ın tiol oksidasyon stokiyometrisi ölçüldü.
Protein peletini rahatsız etmeden asetonu dikkatlice çıkarın. Protein peletinin tamamen çözünür hale getirildiğinden ve hassas bir şekilde nicelleştirildiğinden ve reçinenin spin kolonlarına doğru bir şekilde tahsis edildiğinden emin olun. Yıkama adımları sırasında reçineyi yeniden askıya aldığınızdan emin olun.
Zenginleştirilmiş proteinlerin ve peptitlerin daha ileri değerlendirilmesi SDS-PAGE ve boyama, batı lekelenmesi ve kütle spektrometrisi ile yapılabilir.
