研究钝力损伤对成年斑马鱼影响的可扩展模型

该协议提供了一种简单，快速且可重复的方法来诱导成年斑马鱼的可扩展钝力创伤性脑损伤。经历这种钝力创伤性脑损伤的成年斑马鱼表现出许多在患有钝力TBI的人类中观察到的特征。演示该程序的将是James Hentig先生和Kaylee Cloghessy女士，他们是我实验室的两名博士生。

首先用造型粘土填充培养皿。然后用手指或一对镊子的背面用额外的建模粘土创建一个凸起的平台。使用剃须刀片将凸起的平台纵向分成两个大致相等的两半。

将两半形成一个通道，使其容纳成年鱼的长度。使用额外的粘土来建造墙壁，以确保2/3的鱼体头部暴露在外。在垂直于墙壁的暴露头部区域模制一个小支撑，以避免头部受伤时旋转或反冲。

确保通道的侧面不会阻碍掉落的重量。使用迷你打孔机从 22 号钢闪光灯中创建 3 毫米钢盘。将一条对尾巴捏合无反应的麻醉鱼放在通道内的粘土模具上，其背侧朝上，使其身体固定在侧面。

将3毫米22号钢盘放在头部，以所需冲击点为中心。垂直对齐鱼，以避免其头部向一侧倾斜，这可能会导致不均匀的撞击。使用标准的环形支架和臂夹来固定钢管或塑料管，确保它是直的，因此管的底部在斑马鱼头部上方1.5厘米处。

向下看管道，确保其与钢板上方对齐。根据所需的损伤严重程度选择合适的滚珠轴承。滚珠轴承从预定高度沿着卡套管下降到钢板上。

然后将受伤的鱼放入恢复池中进行监测。用建模粘土填充培养皿，并创建一个小腔以在解剖过程中支撑身体。将鱼放入粘土模具中，背部朝上。

放置两个解剖销，一个穿过身体中间的中线，另一个在头部底部后方约5毫米处。使用一对5个Dumont镊子钝地切断视神经并去除眼睛。将5个镊子的一端放在右顶板下。

故意做一个剪刀动作，向喙端移动，并取出右额板。然后将鱼顺时针旋转90度。将5个镊子的一端放在左顶板下方，并使用相同的剪刀运动去除左顶板和额板，暴露大脑的整个背侧。

使用5个镊子钝切上颌骨，使嗅球保留不被损坏。使用相同的镊子，卸下右吊钳、前吊钳、互操作器和子吊钳。然后钝地切除牙龈尾端的肌肉组织，以暴露脊髓。

使用镊子，钝性地切除脊髓。将镊子小心地放在大脑下方，轻轻地将大脑从髑髅地取出。使用文本手稿中的说明解剖整个大脑或感兴趣的区域，并使用精细的镊子立即将大脑放在小称重船上，注意不要刺伤或刮伤大脑。

将大脑转移到焦油干燥称重船上，并记录大脑的湿重。调整大脑的方向，将它们平放在称重船上，背侧朝上。然后将大脑和干燥的称重船放入设置为60摄氏度的杂交烤箱中八小时。

要将大脑转移到一个新的焦油小秤上，一旦它干燥，就把细镊子捏在一起，从大脑的腹侧开始，向上舀。在湿海绵上做一个部分切口。一次将一条鱼放在开口处，腹侧朝上，并使用30号针将大约40微升的10毫摩尔EdU注入鱼体内。

然后将鱼放回装满系统水的储水箱。如前所述收集大脑，并将它们作为一组放置在一个9毫升的玻璃小瓶中，该小瓶含有2毫升的9份100%乙醇到一份37%甲醛。将大脑固定在4摄氏度的摇臂平台上。

使用低温恒温器卡盘将大脑嵌入TFM中，在干冰上以所需的方向嵌入。血管损伤被发现是通过该模型识别成功损伤的最简单和最突出的病理之一。识别指标的能力随着受伤期间使用的鱼品系而变化。

野生AB型的血管损伤的鉴定很难区分轻度或中度TBI和未受损的对照鱼，因为色素沉着。受伤后，轻度TBI鱼的表面擦伤很小，而中度TBI鱼表现出有限的脑出血。损伤程度在严重的TBI鱼中很明显。

相比之下，使用白化病或Casper鱼时可以很容易地识别血管损伤。使用水肿评估由于损伤引起的脑肿胀。相比之下，中度TBI和重度TBI都有明显的水肿，1 dpi和3 dpi，但中度TBI和重度TBI的液体含量恢复到类似于5 dpi的未受损对照的水平。

这种钝力损伤导致横跨神经轴的强烈细胞增殖反应。与未受损的对照组相比，在前脑的心室和脑室下区域观察到EdU标记增加。与未受损的鱼脑相比，受伤的大脑在脑室周围灰色区域，光学直肠叶和下丘脑前部方面显示出增加的EdU标记。

在严重TBI之后，与未受损的大脑相比，后脑中的神经源性区域表现出增加的细胞增殖。为了正确诱导伤害，请确保鱼在模具中固定和稳定，并且管子是直的，以避免偏离中心冲击或改变重量下降轨迹。该程序提供了一种快速且具有成本效益的钝力损伤诱导方法，应用于再生模型，特别适用于重复的头部创伤或损伤诱导的再生研究。