Этот протокол обеспечивает простой, быстрый и воспроизводимый метод для индуцирования масштабируемой черепно-мозговой травмы тупой силой у взрослых рыбок данио. Взрослые рыбки данио, которые подвергаются этой черепно-мозговой травме тупой силой, демонстрируют многие характеристики, наблюдаемые у людей, которые страдают от тупой ЧМТ. Демонстрировать процедуру будут г-н Джеймс Хентиг и г-жа Кейли Клогесси, два докторанта из моей лаборатории.
Начните с наполнения чашки Петри пластильной глиной. Затем используйте пальцы или заднюю часть пары щипцов, чтобы создать приподнятую платформу с дополнительной моделирующей глиной. Разделите приподнятую платформу вдоль на две примерно равные половины с помощью лезвия бритвы.
Сформируйте две половинки в канал, чтобы он вмещал длину взрослой рыбы. Используйте дополнительную глину для строительства стен, чтобы закрепить 2/3 тела рыбы с открытой головой. Заформуйте небольшую опору в открытой области головы перпендикулярно стенам, чтобы избежать вращения или отдачи головы при травме.
Убедитесь, что боковые стороны канала не препятствуют падению веса. Используйте мини-дырокол для создания 3-миллиметрового стального диска из мигающей стали 22-го калибра. Поместите анестезируемую рыбу, не реагирующую на зажатие хвоста на глиняной плесени в канале спинной стороной вверх, чтобы ее тело было закреплено по бокам.
Поместите 3-миллиметровый стальной диск 22-го калибра на головку, центрированную над нужной точкой удара. Выровняйте рыбу перпендикулярно, чтобы ее голова не наклонялась в одну сторону, что может привести к неравномерному удару. Используйте стандартную кольцевую подставку и зажим для рычага, чтобы закрепить стальную или пластиковую трубку, гарантируя, что она прямая, поэтому дно трубки находится на 1,5 сантиметра выше головы рыбки данио.
Посмотрите вниз на трубку, чтобы убедиться, что она выровнена над стальной пластиной. Выберите подходящий шарикоподшипник, исходя из желаемой тяжести травмы. Опустите шарикоподшипник с заданной высоты вниз по трубе на стальную пластину.
Затем поместите раненую рыбу в резервуар для восстановления для наблюдения. Наполните чашку Петри моделирующей глиной и создайте небольшую полость для поддержки тела во время рассечения. Поместите рыбу в глиняную форму спинной стороной вверх.
Поместите два штыря для рассечения, один через среднюю линию на полпути вниз по телу, а другой примерно на 5 миллиметров за основанием головы. Используйте пару из 5 щипцов Дюмона, чтобы тупо перерезать зрительный нерв и удалить глаза. Поместите один конец из 5 щипцов под правую теменную пластину.
Сделайте преднамеренное ножничное действие, двигаясь к ростральному концу и снимите правую фронтальную пластину. Затем поверните рыбу на 90 градусов по часовой стрелке. Поместите один конец 5 щипцов под левую теменную пластину и используйте то же движение ножницами, чтобы удалить левую теменную и фронтальную пластины, обнажая весь спинной аспект мозга.
Используйте 5 щипцов, чтобы тупо трансецировать верхнюю челюсть так, чтобы обонятельные луковицы сохранились и не были повреждены. Используя те же щипцы, удалите правую оперкул, предоперку, интероперкул и субоперкул. Затем тупо резекция мускулатуры на каудальном конце кальвария, чтобы обнажить спинной мозг.
Используя щипцы, тупо перерезайте спинной мозг. Аккуратно поместите щипцы под мозг и аккуратно удалите мозг из кальвария. Рассекните весь мозг или интересующую область, используя инструкции в текстовой рукописи, и поместите мозг немедленно на небольшую весовую лодку, используя тонкие щипцы, следя за тем, чтобы не заколоть или не соскрести мозг.
Перенесите мозг на смоляную сушильную весовую лодку и запишите влажный вес мозга. Сориентируйте мозги, чтобы положить их на весовую лодку спинной стороной вверх. Затем поместите мозг и сушильную весовую лодку в гибридизационную печь, установленную на 60 градусов Цельсия в течение восьми часов.
Чтобы перенести мозг на новую смолистую маленькую весовую лодку, как только она высохнет, сжимайте тонкие щипцы вместе и, начиная с вентральной стороны мозга, зачерпывайте движение вверх. Сделайте частичный разрез на влажной губке. Поместите по одной рыбе за раз в отверстие вентральной стороной вверх и используйте иглу 30-го калибра, чтобы ввести примерно 40 микролитров 10 миллимоляров EdU в тело рыбы.
Затем верните рыбу в резервуар для хранения, заполненный системной водой. Соберите мозги, как упоминалось ранее, и поместите их как группу в 9-миллилитровый стеклянный флакон, содержащий 2 миллилитра из девяти частей 100% этанола на одну часть 37% формальдегида. Зафиксируйте мозги при 4 градусах Цельсия на платформе коромысла.
Используйте криостатный патрон, чтобы встроить мозг в TFM в нужной ориентации на сухом льду. Было обнаружено, что повреждение сосудов является одной из самых простых и заметных патологий для выявления успешной травмы с помощью этой модели. Способность идентифицировать показатель изменяется при напряжении рыбы, используемой во время травмы.
Идентификацию сосудистого повреждения у дикого типа AB было трудно различить между легкой или умеренной ЧМТ и неповрежденными контрольными рыбами из-за пигментации. После травмы легкая рыба ЧМТ показала минимальные поверхностные ссадины, в то время как умеренная рыба ЧМТ продемонстрировала ограниченное кровоизлияние в мозг. Степень травмы была очевидна у тяжелой ЧМТ рыбы.
Напротив, повреждение сосудов может быть легко идентифицировано при использовании рыбы-альбиноса или каспера. Отек головного мозга из-за травмы оценивали с помощью отека. Напротив, как умеренная ЧМТ, так и тяжелая ЧМТ имели значительный отек, 1 dpi и 3 dpi, но содержание жидкости как умеренной ЧМТ, так и тяжелой ЧМТ вернулось к уровням, напоминающим неповрежденные контрольные значения на 5 dpi.
Это тупое силовое повреждение привело к надежной реакции пролиферации клеток, охватывающей нейрооси. Повышенная маркировка EdU наблюдалась в желудочковой и субвентрикулярной зонах переднего мозга по сравнению с неповрежденной контрольной группой. Поврежденный мозг показал повышенную маркировку EdU в перивентрикулярной серой зоне, оптических тектальных долях и аспектах переднего гипоталамуса по сравнению с неповрежденным мозгом рыбы.
После тяжелой ЧМТ нейрогенные области в заднем мозге демонстрировали повышенную пролиферацию клеток по сравнению с неповрежденным мозгом. Для правильной индукции травмы убедитесь, что рыба закреплена и стабильна в пресс-форме, и что трубка прямая, чтобы избежать удара вне центра или изменить траекторию падения веса. Эта процедура обеспечивает быстрый и экономически эффективный метод индукции тупой силовой травмы, применяемый к регенеративной модели, который будет особенно применим для повторных травм головы или регенеративных исследований, вызванных травмой.
