פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה, מהירה וניתן לשחזור כדי לגרום לפגיעה מוחית טראומטית בכוח קהה מדרגי בדגי זברה בוגרים. דגי הזברה הבוגרים העוברים את הכוח הבוטה הזה פגיעה מוחית טראומטית מציגים רבים מהמאפיינים שנצפו בבני אדם הסובלים מכוח בוטה TBI. שיוכיחו את ההליך יהיו מר ג'יימס הניג וגברת קיילי קלוגסי, שני דוקטורנטים מהמעבדה שלי.
התחל על ידי מילוי צלחת פטרי עם חימר דוגמנות. לאחר מכן השתמש באצבעות או בחלק האחורי של זוג מלקחיים כדי ליצור פלטפורמה מוגבהת עם חימר דוגמנות נוסף. מחלקים את הפלטפורמה המוגבהת לאורכה לשני חצאים שווים בקירב באמצעות סכין גילוח.
יוצרים את שני החצאים לתוך ערוץ, כך שהוא מתאים לאורכו של דג בוגר. השתמש חימר נוסף כדי לבנות קירות כדי לאבטח 2/3 של גוף הדג עם הראש חשוף. לעצב תמיכה קטנה באזור הראש החשוף בניצב לקירות כדי למנוע סיבוב או נרתע של הראש על פציעה.
ודא כי הצדדים של הערוץ אינם לעכב את המשקל ירד. השתמש ניקוב חור מיני כדי ליצור דיסק פלדה 3 מ"מ מהבהב פלדה 22 מד. מניחים דג מרדים שאינו מגיב לזנב צובט על תבנית החימר בתוך התעלה עם צדו האחורי למעלה, כך שגופו מאובטח בצדדים.
הנח את דיסק הפלדה 22 מ"מ 3 מ"מ על הראש, במרכזו מעל נקודת הפגיעה הרצויה. יישר את הדג בניצב כדי למנוע מראשו להטות לצד אחד, מה שעלול לגרום לפגיעה לא אחידה. השתמש במעמד טבעת סטנדרטי ובמהדק זרוע כדי לאבטח את צינורות הפלדה או הפלסטיק, והבטח שהוא ישר, כך שתחתית הצינורות היא 1.5 ס"מ מעל ראשו של דג הזברה.
תסתכל למטה הצינורות כדי להבטיח שהוא מיושר מעל צלחת הפלדה. בחר את מיסוי הכדור המתאים בהתבסס על חומרת הפציעה הרצויה. זרוק את נושאת הכדור מגובה קבוע מראש במורד הצינורות על צלחת הפלדה.
ואז למקם את הדגים הפצועים במיכל ההתאוששות כדי להיות במעקב. מלא צלחת פטרי עם חימר דוגמנות וליצור חלל קטן כדי לתמוך בגוף במהלך הניתוח. מניחים את הדג בתבנית החימר עם צד הגוזל למעלה.
מניחים שני סיכות דיסקציה, אחת דרך קו האמצע באמצע הגוף והשנייה כ-5 מ"מ מאחורי בסיס הראש. השתמש בזוג של 5 מלקחיים דומונט לנתק בבוטות את עצב הראייה ולהסיר את העיניים. מניחים קצה אחד של 5 מלקחיים מתחת לצלחת הקודקוד הימנית.
בצע פעולת מספריים מכוונת נע לכיוון קצה rostral ולהסיר את הלוח הקדמי הימני. ואז לסובב את הדג 90 מעלות בכיוון השעון. מניחים קצה אחד של 5 המלקחיים מתחת לצלחת הקודקוד השמאלית ומשתמשים באותה תנועת מספריים כדי להסיר את הלוחות הקודקודיים והחזיתיים השמאליים, וחושפים את כל ההיבט העורי של המוח.
השתמש 5 מלקחיים כדי להעביר בבוטות את maxilla כך נורות הריח נשמרים ולא ניזוקו. באמצעות אותם מלקחיים, הסר את האופל הימני, ניתוח מקדים, פעולה משולבת ותת-ניתוח. ואז בבוטות לכרות את השרירים בקצה caudal של calvarium לחשוף את חוט השדרה.
באמצעות המלקחיים, תקיף בבוטות את חוט השדרה. מניחים את המלקחיים בזהירות מתחת למוח ולהסיר בעדינות את המוח מהקלבריום. לנתח את כל המוח או אזור העניין באמצעות ההוראות בכתב היד הטקסט, ולהניח את המוח מיד על סירת שקילה קטנה באמצעות מלקחיים עדינים, תוך דאגה לא לדקור או לגרד את המוח.
מעבירים את המוח לסירה השקילה של ייבוש זפת ומתעדים את המשקל הרטוב של המוח. כוון את המוחות להניח אותם שטוחים על סירת השקילה כשצד החזיר פונה כלפי מעלה. לאחר מכן מניחים את המוח ואת ייבוש שוקל סירה בתנור הכלאה להגדיר 60 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות.
כדי להעביר את המוח לסירה קטנה מזופתת חדשה ברגע שהיא יבשה, צבוט את המלקחיים העדינות יחד, והחל מהצד הגחון של המוח, לגרוף בתנועה כלפי מעלה. לעשות חבטה חלקית על ספוג רטוב. מניחים דג אחד בכל פעם בפתח עם הצד הגחון למעלה ולהשתמש במחט 30 מד להזריק כ 40 microliters של 10 מילימולר EdU לתוך הגוף של הדג.
לאחר מכן החזירו את הדג למיכל ההחזקה המלא במי מערכת. לאסוף את המוחות כאמור, וממקם אותם כקבוצה ב בקבוקון זכוכית 9 מיליליטר המכיל 2 מיליליטר של תשעה חלקים 100%אתנול לחלק אחד 37%פורמלדהיד. תקן את המוח ב-4 מעלות צלזיוס על משטח נדנדה.
השתמש צ'אק cryostat להטמיע את המוח ב- TFM באוריינטציה הרצויה על קרח יבש. פגיעה בכלי הדם נמצאה כאחת הפתולוגיות הקלות והבולטות ביותר לזיהוי פגיעה מוצלחת באמצעות מודל זה. היכולת לזהות את המחוון השתנתה עם זן הדגים המשמשים במהלך הפציעה.
זיהוי של פגיעה בכלי הדם בסוג בר AB היה קשה להבחין בין TBI מתון או בינוני ודגי בקרה ללא פגע עקב הפיגמנטציה. בעקבות הפציעה, דגי TBI הקלים הציגו שריטות משטח מינימליות, בעוד דגי TBI המתונים הציגו דימום מוחי מוגבל. היקף הפגיעה ניכר בדגי TBI קשים.
לעומת זאת, פגיעה בכלי הדם ניתן לזהות בקלות בעת שימוש לבקן או דג קספר. נפיחות במוח עקב פציעה הוערך באמצעות בצקת. לעומת זאת, הן TBI מתון והן TBI חמור היה בצקת משמעותית, 1 dpi ו 3 dpi, אבל התוכן הנוזלי של TBI מתון ו TBI חמור חזר לרמות הדומה פקדים ניזוקו על ידי 5 dpi.
פגיעה זו בכוח קהה הביאה לתגובת התפשטות תאים חזקה המשתרעת על פני הנוירוקסיס. תיוג EdU מוגבר נצפה באזורי החדר והתת-חדרי של החזה לעומת פקדים שלא ניזוקו. המוחות הפצועים הציגו תיוג מוגבר של EdU באזור האפור הצחיח, באונות הקטקל האופטיות ובהיבטים של ההיפותלמוס החלקירי בהשוואה למוח הדגים שלא ניזוק.
בעקבות TBI חמור, אזורים נוירוגניים במוח האחורי הציגו התפשטות תאים מוגברת בהשוואה למוח שלא ניזוק. עבור אינדוקציה נכונה של הפגיעה, להבטיח את הדגים מאובטחים ויציבים בתבנית, וכי הצינורות הוא ישר כדי למנוע השפעה מחוץ למרכז או לשנות את מסלול ירידת המשקל. הליך זה מספק שיטת אינדוקציה מהירה וחסכונית של פגיעה בכוח קהה המיושמת על מודל רגנרטיבי שיהיה ישים במיוחד עבור טראומת ראש חוזרת ונשנית או מחקרים רגנרטיביים הנגרמים מפציעות.
