Este protocolo fornece um método simples, rápido e reprodutível para induzir uma lesão cerebral traumática escalável em zebrafish adulto. Os zebrafish adultos que sofrem essa lesão cerebral traumática por força bruta apresentam muitas das características observadas em humanos que sofrem de uma TBI de força bruta. Demonstrando o procedimento estarão o Sr. James Hentig e a Sra. Kaylee Cloghessy, dois doutorandos do meu laboratório.
Comece preenchendo uma placa de Petri com argila modeladora. Em seguida, use os dedos ou a parte de trás de um par de fórceps para criar uma plataforma elevada com argila de modelagem adicional. Divida a plataforma elevada longitudinalmente em duas metades aproximadamente iguais usando uma lâmina de barbear.
Forme as duas metades em um canal, de tal forma que acomode o comprimento de um peixe adulto. Use argila adicional para construir paredes para proteger 2/3 do corpo de peixe com a cabeça exposta. Molde um pequeno suporte na região da cabeça exposta perpendicular às paredes para evitar rotação ou recuo da cabeça após o ferimento.
Certifique-se de que os lados do canal não impeçam o peso caído. Use um mini furo para criar um disco de aço de 3 milímetros a partir de um pisca-pisca de aço de calibre 22. Coloque um peixe anestesiado sem resposta para a pinça de cauda no molde de argila dentro do canal com seu lado dorsal para cima para que seu corpo seja fixado nas laterais.
Coloque o disco de aço de calibre 3 mm 22 na cabeça, centrado sobre o ponto de impacto desejado. Alinhe o peixe perpendicularmente para evitar que sua cabeça se incline para um lado, o que poderia causar um impacto desigual. Use um suporte de anel padrão e um grampo de braço para fixar o tubo de aço ou plástico, garantindo que ele seja reto, de modo que a parte inferior do tubo está 1,5 centímetros acima da cabeça do zebrafish.
Olhe para baixo a tubulação para garantir que ela esteja alinhada acima da placa de aço. Escolha o rolamento adequado do esfera com base na gravidade desejada da lesão. Solte o rolamento da esfera de uma altura predeterminada para baixo da tubulação sobre a placa de aço.
Em seguida, coloque os peixes feridos no tanque de recuperação para serem monitorados. Encha uma placa de Petri com argila modeladora e crie uma pequena cavidade para apoiar o corpo durante a dissecação. Coloque o peixe no molde de argila com o lado dorsal para cima.
Coloque dois pinos de dissecção, um através da linha média no meio do corpo e outro cerca de 5 milímetros atrás da base da cabeça. Use um par de 5 fórceps Dumont para cortar sem rodeios o nervo óptico e remover os olhos. Coloque uma extremidade dos 5 fórceps sob a placa parietal direita.
Faça uma ação deliberada de tesoura movendo-se em direção à extremidade rostral e remova a placa frontal direita. Em seguida, gire o peixe 90 graus no sentido horário. Coloque uma extremidade dos 5 fórceps sob a placa parietal esquerda e use o mesmo movimento da tesoura para remover as placas parietal e frontal esquerda, expondo todo o aspecto dorsal do cérebro.
Use os 5 fórceps para transcessão direta da maxila de tal forma que as lâmpadas olfativas sejam preservadas e não danificadas. Usando os mesmos fórceps, remova o operáculo direito, o preopercle, o interopercle e o subóculo. Em seguida, ressecção direta da musculatura na extremidade caudal do calvério para expor a medula espinhal.
Usando os fórceps, transcessão sem rodeios da medula espinhal. Coloque as fórceps cuidadosamente sob o cérebro e remova suavemente o cérebro do calvarium. Disseque todo o cérebro ou região de interesse usando as instruções do manuscrito do texto, e coloque o cérebro imediatamente em um pequeno barco de pesagem usando fórceps finos, tomando cuidado para não esfaquear ou raspar o cérebro.
Transfira o cérebro para o barco de pesagem de secagem e regisse o peso úmido do cérebro. Oriente os cérebros para colocá-los no barco de pesagem com o lado dorsal virado para cima. Em seguida, coloque o cérebro e o barco de pesagem de secagem em um forno de hibridização definido a 60 graus Celsius por oito horas.
Para transferir o cérebro para um novo pequeno barco de pesagem, uma vez que esteja seco, aperte os fórceps finos juntos e, começando pelo lado ventral do cérebro, colher em um movimento ascendente. Faça uma incisão parcial em uma esponja molhada. Coloque um peixe de cada vez na abertura com o lado ventral para cima e use uma agulha de calibre 30 para injetar aproximadamente 40 microliters de 10 milimôlares EdU no corpo do peixe.
Em seguida, devolva o peixe para o tanque de retenção cheio de água do sistema. Colete os cérebros como mencionado anteriormente, e coloque-os como um grupo em um frasco de vidro de 9 mililitros contendo 2 mililitros de nove partes 100% etanol para uma parte 37% formaldeído. Conserte os cérebros a 4 graus Celsius em uma plataforma de roqueiro.
Use um mandril criostat para incorporar os cérebros em TFM na orientação desejada sobre gelo seco. A lesão vascular foi considerada uma das patologias mais fáceis e proeminentes para identificar lesões bem sucedidas através deste modelo. A capacidade de identificar o indicador mudou com a cepa de peixes utilizada durante a lesão.
A identificação de lesões vasculares no tipo AB selvagem foi difícil de distinguir entre TBI leve ou moderada e peixe de controle não danificado devido à pigmentação. Após a lesão, o peixe TBI leve apresentou escoriações mínimas da superfície, enquanto os peixes TBI moderados apresentaram hemorragia cerebral limitada. A extensão da lesão foi aparente em peixes TBI graves.
Em contraste, a lesão vascular pode ser facilmente identificada ao usar peixe albino ou casper. O inchaço do cerebrum devido à lesão foi avaliado por edema. Em contraste, tanto o TCE moderado quanto o TCE grave apresentaram edema significativo, 1 dpi e 3 dpi, mas o teor fluido tanto de TBI moderado quanto de TCE grave retornou a níveis semelhantes a controles não danificados por 5 dpi.
Esta lesão por força bruta resultou em uma resposta robusta de proliferação celular abrangendo a neuroaxis. O aumento da rotulagem edu foi observado nas zonas ventricular e subventricular do cérebro em comparação com controles não danificados. Os cérebros feridos apresentaram aumento da rotulagem edu na zona cinza periventricular, os lobos tectal ópticos, e aspectos do hipotálamo anterior em comparação com o cérebro de peixe não danificado.
Após tce-TBI grave, regiões neurogênicas no cérebro traseiro apresentaram aumento da proliferação celular em comparação com o cérebro não danificado. Para a indução adequada da lesão, certifique-se de que os peixes estejam protegidos e estáveis no molde, e que a tubulação seja reta para evitar o impacto fora do centro ou alterar a trajetória de queda de peso. Este procedimento fornece um método de indução de lesão por força bruta rápida e econômica aplicado a um modelo regenerativo que seria especialmente aplicável para repetidos traumatismo craniano ou estudos regenerativos induzidos por lesões.
