الأوعية الدموية في الدماغ هي شبكة معقدة من اختراق الشرايين والشعيرات الدموية والفينولا الصاعدة. هذه الأوعية مغطاة بخلايا جدارية، مثل إعادة إحياء البيريسيات، التي تعبر عن أكتين العضلات الملساء ألفا، وتوجد داخل الفروع الأربعة الأولى من اختراق الشرايين. نحن نستخدم Acta2-RCaMP 1.07 الفئران المعدلة وراثيا، لتصور عابري الكالسيوم في هذه الخلايا، من خلال التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا RCaMP.
الكالسيوم يلعب دورا قويا في تقلص هذه الخلايا والسيطرة على تدفق الدم. تم العثور على pericytes الشعرية أبعد المصب في شبكة الأوعية الدموية ويمكن أن تكون وصفت في نماذج أخرى المعدلة وراثيا. ومع ذلك، فإننا نركز على إعادة زرع pericytes في هذه الطريقة.
تم زرع فئراننا جراحيا بنافذة قحفية مزمنة تسمح بالوصول إلى الأوعية الدموية في الدماغ للتصوير. هنا، نحدد خطوات التحضير اللازمة وحقن الوريد الذيل تليها طريقتان للتصوير الفوتون والتحليل اللازمة للحصول على بيانات الكالسيوم pericyte والمعلومات حول تدفق الدم في الحيوانات المخدرة. العناصر التالية مطلوبة لحقن قسطرة الوريد الذيل: حقن الأنسولين، قطعة 15 سم من أنابيب PE10، 30 إبر قياس، شاش، المالحة، ملقط، الأخضر الفلورسين dextran صبغ، كماشة، ومقص.
لدينا أيضا إبرة مع التخدير الكيتامين Xylazine أننا سوف حقن قبل التصوير كما هو أفضل من isoflurane لقياس تدفق الدم. باستخدام كماشة، كسر إبرة قياس 30 من المحور. أدخل الإبرة بعناية في نهاية قطعة أنابيب PE10 المرفقة بحقنة مملوءة بالمحلول الملحي.
هذا هو القسطرة للحقن. تخدير الماوس مع isoflurane وتطبيق هلام I-لوب. ضع حقل قفاز مع الماء الدافئ على الذيل لتوسيع الوريد الجانبي.
بعد تنظيف الذيل بالإيثانول، أدخل الإبرة في الوريد وحقن المالحة برفق من خلال القسطرة لضمان وضع الإبرة بشكل صحيح. قم بتبديل المحاقن على القسطرة للحصول على حقنة مليئة بصبغة الفلورسين ديكتران. حقن ببطء صبغ للتأكد من عدم وجود فقاعات دخول الأنبوب.
استبدل حقنة الدكستران بحقنة ملحية وشطف الأنابيب حتى لا تترك صبغة في الأنبوب. إزالة الإبرة واضغط بالشاش. حقن الكيتامين Xylazine التخدير للتصوير.
مع رأس الماوس ثابتة على وسادة التدفئة، وتنظيف نافذة الجمجمة مع قضيب الأسنان. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على النافذة والتركيز من خلال اثنين من هدف المجهر فوتون. بالنسبة لتصوير الفوتونين، نستخدم مجهرا مزودا بليزر ياقوت التيتانيوم القابل للضبط للفلورسنت والإثارة وأنابيب التمائم الضوئي للكشف عن الانبعاثات.
في برنامج المجهر، تعيين الطول الموجي إلى 990 نانومتر لإثارة كل من RCaMP وفلوريسيين ديكتران. تعيين المقبل قوة الليزر عن طريق ضبط الجهد خلية بوكيل وحساسية كاشف PMT. يمكن رؤية المسح الحي مع هذه المعلمات ودقة أعلى ، والخلايا الجدارية الإيجابية RCaMP وبلازما الدم المسماة فلوريا.
يوصى بالحصول على كومة عمق لتحديد موقع pericytes بشكل صحيح في شبكة الأوعية الدموية. عندما تركز في الجزء العلوي من الأنسجة بالقرب من السفن PO، تعيين هذا كنقطة الصفر وأعلى كومة سلسلة زيد، ثم التركيز إلى أسفل في الأنسجة إلى العمق المطلوب وتعيين هذا الجزء السفلي من المكدس. يجب تعديل قوة الليزر لزيادة المجهر يتحرك أعمق من خلال المكدس.
فتح سلسلة زيد في برامج معالجة الصور، ودمج القناتين كصور ملونة ومسح من خلال كومة للبيريسيت والأوعية الدموية ذات الأهمية. حدد المناطق ذات الاهتمام التي تحتوي على pericytes وحفظ المواقف للمساعدة في تحديد مواقع هذه البقع مرة أخرى في جلسات التصوير المستقبلية. لجمع ونقل حدث الكالسيوم بيريسيت، زيادة معدل إطار الاستحواذ إلى أكثر من 10 إطارات في الثانية الواحدة.
تعيين مدة التصوير إلى 60 ثانية وتحديث مسار الحفظ باسم ملف فريد. تكبير بصريا على السفينة لحساب انخفاض القرار والحصول على رؤية أقرب من pericyte. الحصول على سلسلة T.
لقياس قطر الأوعية الدموية وسرعة خلايا الدم الحمراء، حدد مسح الخط لبدء مسح أحادي الأبعاد بالمجهر. تعيين مدة المسح الضوئي في ميلي ثانية. ثم رسم خط يقسم السفينة من الفائدة ويتحرك بالتوازي على طول السفينة.
وهذا سوف يولد kymograph قطر السفينة على اليسار والشرائط من خلايا الدم الحمراء تتحرك من خلال الوعاء على اليمين. راجع جدول المواد للحصول على قائمة كاملة بالبرامج والحزم المستخدمة في هذا البروتوكول. أول اختيار المناطق ذات الاهتمام باليد في برامج معالجة الصور.
تحميل ملف سلسلة T، تأخذ متوسط المكدس، وجعل صورة ملونة. حدد أداة المضلع وحدد الخطوط العريضة لهياكل المحيط المحيط المرئية مثل سوما والعمليات. إعطاء كل منطقة من الفائدة اسما فريدا وحفظها كمجلد الرمز البريدي التي يمكن تحميلها في وقت لاحق في برنامج البرمجة.
افتح برنامج البرمجة وتأكد من أن المجلدات الخاصة بحزم معالجة الصور على المسار. استيراد سلسلة الكالسيوم تي في برنامج البرمجة وتحديد ما هو على كل قناة. في هذه الحالة، هو إشارة الخلوية على القناة الأولى وبلازما الدم على القناة الثانية.
رسم البيانات كفيلم ضمن برنامج البرمجة لتسهيل التصور. لإزالة الفلورسنت الأخضر من الفلورسين ديكستروان الذي ينزف من خلال قناة RCaMP الحمراء، قم بإلغاء مزج القنوات في حزمة معالجة الصور. حدد أولا منطقة تحتوي فقط على الفلوروفور 1، RCaMP في هذه الحالة.
حدد ثاني منطقة تحتوي فقط على الفلوروفور 2، الفلورسين في البلازما. وأخيرا حدد منطقة خلفية لا تحتوي على أي من الفلوروفور. وهذا يولد مصفوفة مساهمة طيفية، والتي يتم تطبيقها على كل بكسل في كل قناة.
وهو يحسن بشكل كبير توطين إشارة RCaMP ، مما سيعزز الكشف عن أحداث الكالسيوم في هذه الهياكل. هناك طرق متعددة يمكن من خلالها تحليل بيانات تصوير الكالسيوم داخل حزم معالجة الصور. قم أولا بتشغيل تحليل الإشارات الخلوية على فيلم الكالسيوم غير الملساء وتحميل المناطق ذات الاهتمام من مجلد الرمز البريدي التي تم اختيارها من pericytes باليد في وقت سابق.
تعيين عامل المقياس إلى واحد لأن المناطق لا تحتاج إلى تغيير حجمها. بعد المعالجة، توليد قطع من كل روي وآثار الكالسيوم تطبيع في ألوان مختلفة. إذا لم يكشف التعليمات البرمجية معظم أحداث الكالسيوم في تتبعات الفردية تعديل المعلمات المضمنة داخل مربع التحسين مثل تقليل عتبة البيانات التي تمت تصفيتها تمرير قصيرة إلى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري لفترة الأساس، وهو أول 30 إطار من سلسلة T.
من أجل الكشف عن وتصنيف الإشارات ، فإن تتبع الكالسيوم العادي هو تمرير طويل وتمرير النطاق تمت تصفيته ، مما يساعد على تسهيل البيانات للسعة ومع التقديرات ، ولكن أيضا لتحديد ما إذا كانت الإشارات قمم واحدة أو قمم متعددة أو هضاب. إخراج البيانات كملف CSV لمزيد من التحليل الإحصائي. قم بتشغيل تحليل الإشارات الخلوية للمرة الثانية على فيلم الكالسيوم غير المهول وحدد المنطقة التلقائية لتحديد الفائدة استنادا إلى النشاط والتغيير في الفلورسنت في ثلاثة أبعاد ، X و Y والوقت.
رسم نتائج العملية لعرض المناطق المحددة ذات الاهتمام هو ألوان مختلفة. إذا لم تكتشف الخوارزمية ROYs التي تكون مرئية بوضوح بالعين في الفيلم، قم بتعديل المعلمات المضمنة، مثل زيادة عامل التصفية Gaussian الذي يتجانس البيانات في الوقت المناسب ويخفض عتبة البحث عن ROYs إلى ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري لخط الأساس. رسم ROYs كفيلم لمزيد من التصور.
إخراج البيانات كملف CSV لمزيد من التحليل الإحصائي. استيراد خط مسح ملف بيانات kymograph في برنامج البرمجة وتحديد ما هو على كل قناة. تشغيل وظيفة تحليل القطر على خط المسح الضوئي، الذي يفتح مربع لتحديد المنطقة التي تتوافق مع القطر في kymograph.
رسم مربع خارج الحدود الفلورية kymograph، التي تتوافق مع قطر السفينة. معالجة هذه الفئة من البيانات من أجل قياس العرض الكامل في نصف ماكسيما القطر السفينة وتوليد قطعة أرض. تشغيل المقبل معدل السرعة على تحليل التحول ورسم مربع داخل حدود الفلورسنت kymograph.
معالجة هذه الفئة من البيانات من أجل حساب سرعة وتدفق والكثافة الخطية لخلايا الدم الحمراء. إخراج نتائج تدفق الدم كملف CSV لمزيد من التحليل. اختيار الهياكل الخلوية باليد يسمح بالكشف عن تقلبات الكالسيوم داخل هذه المناطق، بما في ذلك أنواع مختلفة من قمم الإشارات، مثل قمم واحدة وقمم متعددة، بعد آثار الكالسيوم تطبيع منخفضة تمرير وتمرير النطاق تصفيتها.
بالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد المناطق ذات الاهتمام عن طريق تجميع وحدات البكسل النشطة معا حيث تتغير كثافة الفلورسنت بمرور الوقت باستخدام خوارزميات معالجة الصور. ويمكن تطبيق ذلك على أي إشارة خلوية ديناميكية عن طريق ضبط الوقت والعتبة والمعلمات المكانية لتشمل الحجم والشكل المتوقعين للإشارة. إن خفض عتبة تحديد الإشارة يجد المزيد من المناطق ذات الأهمية.
يتم تحليل الكيموغرافات الهيمودينامية الواضحة لقياس القطر وسرعة خلايا الدم الحمراء في الأوعية الدموية بالقرب من بيريسيتس الورثة. يتم حساب القطر من العرض الكامل بنصف الحد الأقصى للفلورسنت. يتم تقريب سرعة خلايا الدم الحمراء من الشرائط المصنوعة من خلايا الدم الحمراء غير الم عليها ، حيث يتم إدخال الزاوية في تحويل الرادون لحساب السرعة.
الكيموغرافيات ذات الجودة الرديئة ، حيث يوجد تشبع فلوري ، أو إشارة ضعيفة إلى نسبة الضوضاء ، أو حركة مجال التصوير ، تخلق مؤامرات غير موثوقة مع نقاط خطأ ، يشار إليها على أنها صليب أحمر ، حيث لا يمكن تحديد البيانات. نوعية البيانات المكتسبة أمر بالغ الأهمية لتحقيق نتيجة جيدة واتباع الخطوات المذكورة في هذا البروتوكول يضمن نتائج جيدة. في هذا الفيديو، نحدد إجراءات التصوير بالكالسيوم المشترك لغشاء بيريسيت الدماغ وقياسات تدفق الدم عن طريق اثنين من المجهر الفوتوني.
هذه التقنيات مفيدة لمعالجة الأسئلة حول فسيولوجيا الخلايا الجدارية والتوطين داخل شبكة الأوعية الدموية في الدماغ ، ولكن يمكن تكييفها لدراسة عابري الكالسيوم في أي نوع من الخلايا في الدماغ أو نظام الأعضاء الأخرى.
