Сосудистая система головного мозга представляет собой сложную сеть проникающих артерий, капилляров и восходящих венул. Эти сосуды заключены в муральные клетки, такие как перициты, которые экспрессируют альфа-актин гладких мышц, и находятся в первых четырех ветвях от проникающих артерий. Мы используем трансгенных мышей Acta2-RCaMP 1.07 для визуализации переходных процессов кальция в этих клетках посредством экспрессии генетически закодированного индикатора кальция RCaMP.
Кальций играет важную роль в сокращении этих клеток и контроле кровотока. Капиллярные перициты находятся дальше вниз по течению в сосудистой сети и могут быть помечены в других трансгенных моделях. Тем не менее, мы фокусируемся на окутывающих перицитах в этом методе.
Нашим мышам хирургически имплантировали хроническое черепное окно, которое обеспечивает доступ к сосудистой системы мозга для визуализации. Здесь мы описываем необходимые этапы подготовки и инъекцию хвостовой вене, за которыми следуют две фотонные визуализации и аналитические методы, необходимые для получения данных о перицитовом кальции и информации о кровотоке у анестезируемых животных. Для инъекции катетера в хвостовую вену требуются следующие предметы: инсулиновые шприцы, 15-сантиметровый кусок трубки PE10, иглы 30 калибра, марля, физиологический раствор, щипцы, краситель зеленый флуоресцеин декстран, плоскогубцы и ножницы.
У нас также есть игла с кетаминовой ксилазиновой анестезией, которую мы будем вводить перед визуализацией, так как она лучше, чем изофлуран для измерения кровотока. Используя плоскогубцы, оторвайте иглу 30 калибра от ступицы. Осторожно вставьте иглу в конец куска трубки PE10, прикрепленного к шприцу, заполненному физиологическим раствором.
Это катетер для инъекций. Обезболить мышь изофлураном и нанести гель I-Lube. Поместите поле перчаток с теплой водой на хвост, чтобы расширить боковую вену.
После очистки хвоста этанолом вставьте иглу в вену и осторожно введите физиологический раствор через катетер, чтобы убедиться, что игла помещена правильно. Переключите шприц на катетер на шприц, наполненный флуоресцеин декстрановой краской. Медленно вводите краситель, чтобы убедиться, что пузырьки не попадают в трубку.
Замените шприц декстрана солевым шприцем и промойте трубку до тех пор, пока в трубке не останется красителя. Снимите иглу и прижмите марлей. Инъекционная кетамин ксилазиновая анестезия для визуализации.
Закрепив головку мыши на грелке, очистите краниальное окно зубными аппликаторами. Нанесите ультразвуковой гель на окно и сфокусироваться через объектив микроскопа с двумя фотонами. Для визуализации двух фотонов мы используем микроскоп с настраиваемым титановым сапфировым лазером для флуоресцентных ламп, возбуждения и фотоумноживающих трубок для обнаружения излучения.
В программном обеспечении микроскопа установите длину волны на 990 нанометров, чтобы возбуждать как RCaMP, так и флуоресцеин декстран. Затем установите мощность лазера, регулируя напряжение ячейки pockel и чувствительность детектора PMT. Живое сканирование с этими параметрами и более высоким разрешением, RCaMP положительные настенные клетки и флуоресцентно меченая плазма крови могут быть замечены.
Приобретение глубинного стека рекомендуется для правильного нахождения перицитов в сосудистой сети. Когда вы сфокусированы в верхней части ткани вблизи сосудов PO, установите это как нулевую точку и верхнюю часть стека серии Zed, затем сфокусироваться вниз в ткани на желаемую глубину и установить это как нижнюю часть стека. Мощность лазера должна быть отрегулирована для увеличения по мере того, как микроскоп движется глубже через стек.
Открыв серию Zed в программном обеспечении для обработки изображений, объедините два канала в виде цветных изображений и просканируйте стек на наличие перицитов и кровеносных сосудов, представляющих интерес. Выберите интересующие области, содержащие перициты, и сохраните позиции, чтобы помочь с поиском этих пятен снова в будущих сеансах визуализации. Чтобы собрать и переместить перицитное событие кальция, увеличьте частоту кадров сбора данных до более чем 10 кадров в секунду.
Установите длительность изображения на 60 секунд и обновите путь сохранения уникальным именем файла. Оптически увеличьте масштаб сосуда, чтобы учесть более низкое разрешение и получить более близкий обзор перицилта. Приобретите серию T.
Чтобы измерить диаметр кровеносных сосудов и скорость эритроцитов, выберите линейное сканирование, чтобы начать одномерное сканирование с помощью микроскопа. Сначала установите длительность сканирования в миллисекундах. Затем проведите линию, которая делит пополам интересуемый сосуд и движется параллельно вдоль сосуда.
Это сгенерирует кимограф диаметра сосуда слева и полосы красных кровяных телец, движущихся по сосуду справа. Полный список программ и пакетов, используемых в этом протоколе, приведен в таблице материалов. Сначала выберите интересующих регионы вручную в программном обеспечении для обработки изображений.
Загрузите файл серии T, возьмите среднее значение стека и сделайте цветное изображение. Выберите инструмент «Полигон» и наметьте видимые обволакивающие перицитные структуры, такие как сома и процессы. Присвойте каждой интересуемой области уникальное имя и сохраните их в виде ZIP-папки, которая может быть загружена позже в программном обеспечении.
Откройте программное обеспечение для программирования и убедитесь, что папки для пакетов обработки изображений находятся в пути. Импортируйте серию кальция T в программное обеспечение и определите, что находится на каждом канале. В данном случае это клеточный сигнал на первом канале и плазма крови на второй канал.
Отоглядите данные в виде фильма в программном обеспечении для облегчения визуализации. Для удаления зеленых флуоресцентных ламп из флуоресцеинового декстрана, который пропускается в красный канал RCaMP, размешайте каналы в пакете обработки изображений. Сначала выберите область, которая содержит только флуорофор 1, в данном случае RCaMP.
Во-вторых выбирают область, которая содержит в плазме только флуорофор 2, флуоресцеин. Наконец, выберите фоновую область, в которой нет флуорофора. Это создает матрицу спектрального вклада, которая применяется к каждому пикселю в каждом канале.
Он значительно улучшает локализацию сигнала RCaMP, что усилит обнаружение кальциевых событий в этих структурах. Существует несколько способов анализа данных визуализации кальция в пакетах обработки изображений. Сначала запустите анализ клеточной сигнализации на несмешанный кальциевый ролик и загрузите интересующие области из zip-папки, которые были выбраны из перицитов вручную ранее.
Установите коэффициент масштабирования на один, так как регионы не нуждаются в изменьше. После обработки сгенерируйте графики каждого ROY и нормализованные следы кальция в разных цветах. Если код не обнаруживает большинство событий кальция в отдельных трассировках, измените встроенные параметры в поле оптимизации, например уменьшите порог для данных с короткой фильтрацией до трехкратного стандартного отклонения базового периода, что является первыми 30 кадрами серии T.
Чтобы обнаружить и классифицировать сигналы, нормализованный след кальция фильтруется с длинным проходом и полосой пропуска, что помогает сгладить данные по амплитуде и с оценками, а также определить, являются ли сигналы одиночными пиками, несколькими пиками или плато. Выведем данные в виде CSV-файла для дальнейшего статистического анализа. Запустите анализ клеточной сигнализации во второй раз на несмешаемой кальциевой ленте и выберите автоматическую идентификацию интересующей области на основе активности и изменения флуоресцентных ламп в трех измерениях: X, Y и времени.
Построение результатов процесса для просмотра идентифицированных областей, представляющих интерес, различными цветами. Если алгоритм не обнаруживает ROY, которые хорошо видны на глаз в фильме, измените встроенные параметры, такие как увеличение гауссовского фильтра, который во времени сглаживает данные, и снижение порога для поиска ROYs в три раза от стандартного отклонения базовой линии. Запланировка ROYs в виде фильма для дальнейшей визуализации.
Выведем данные в виде CSV-файла для дальнейшего статистического анализа. Импортируйте файл данных сканирования линии кимографа в программное обеспечение и определите, что находится на каждом канале. Запустите функцию анализа диаметра на сканировании линии, которая открывает поле для выбора области, соответствующей диаметру в кимографе.
Нарисуйте коробку за пределами границ флуоресцентных ламп кимографа, соответствующую диаметру сосуда. Обработайте этот класс данных, чтобы измерить полную ширину при половинных максимумах для диаметра судна и сгенерировать график. Далее запускаем скоростной коэффициент при анализе трансформации и рисуем коробку внутри границы флуоресцентного кимографа.
Обработайте этот класс данных, чтобы рассчитать скорость, поток и линейную плотность эритроцитов. Выведем результаты кровотока в виде CSV-файла для дальнейшего анализа. Выбор клеточных структур вручную позволяет обнаруживать колебания кальция в этих областях, включая различные типы пиков сигнала, такие как одиночные пики и мультипики, после того, как нормализованные следы кальция фильтруются в нижних и полосовых проходах.
Кроме того, области, представляющие интерес, идентифицируются путем группировки активных пикселей вместе, где интенсивность флуоресцент изменяется с течением времени с использованием алгоритмов обработки изображений. Это может быть применено к любому динамическому сотовому сигналу путем настройки времени, порога и пространственных параметров, чтобы охватить ожидаемый размер и форму сигнала. Снижение порога для идентификации сигнала обнаруживает больше областей, представляющих интерес.
Прозрачные гемодинамические кимографы анализируются для измерения диаметра и скорости эритроцитов в кровеносных сосудах вблизи эншифицированных перицитов. Диаметр рассчитывается из полной ширины при половине максимума флуоресцентных ламп. Скорость эритроцитов аппроксимируется из полос, сделанных из немаркированных эритроцитов, где угол вводится в преобразование радона для расчета скорости.
Низкокачественные кимографы, где присутствует флуоресцентная насыщенность, плохое отношение сигнал/шум или движение поля изображения, создают ненадежные графики с точками погрешности, обозначенными красными крестиками, где данные не могут быть определены. Качество полученных данных имеет решающее значение для хорошего результата, и выполнение шагов, описанных в этом протоколе, обеспечивает хорошие результаты. В этом видео мы описываем процедуру комбинированной кальциевой визуализации перицитов головного мозга и измерения кровотока с помощью двух фотонной микроскопии.
Эти методы полезны для решения вопросов о физиологии и локализации настенных клеток в сосудистой сети мозга, но они могут быть адаптированы для изучения переходных процессов кальция в любом типе клеток в мозге или другой системе органов.
