脑血管系统是一个由穿透性动脉、毛细血管和上行小静脉组成的复杂网络。这些血管被壁画细胞包裹，例如鞘周围细胞，其表达α平滑肌肌肌动蛋白，并且位于穿透动脉的前四个分支内。我们使用Acta2-RCaMP 1.07转基因小鼠，通过遗传编码的钙指示剂RCaMP的表达来可视化这些细胞中的钙瞬变。
钙在这些细胞的收缩和血流控制中起着重要作用。毛细血管周细胞在血管网络的下游更远处被发现，并且可以在其他转基因模型中标记。但是，我们专注于在这种方法中包皮周细胞。
我们的小鼠已经通过手术植入了一个慢性颅窗，允许进入脑血管系统进行成像。在这里，我们概述了必要的准备步骤和尾静脉注射，然后是获取麻醉动物周围钙数据和有关血流信息所需的两种光子成像和分析方法。尾静脉导管注射需要以下物品:胰岛素注射器，15厘米PE10管，30号针头，纱布，盐水，镊子，绿色荧光素葡聚糖染料，钳子和剪刀。
我们还有一个氯胺酮甲苯胺酮麻醉针头，我们将在成像前注射，因为它比异氟醚更适合血流量测量。使用钳子，从轮毂上折断一根30号针。小心地将针头插入连接到充满盐水的注射器上的PE10管的末端。
这是注射用导管。用异氟醚麻醉小鼠并应用I-Lube凝胶。在尾部放置一个装有温水的手套场，以扩张外静脉。
用乙醇清洁尾部后，将针头插入静脉，并通过导管轻轻注射生理盐水，以确保针头正确放置。将导管上的注射器切换为充满荧光素葡聚糖染料的注射器。缓慢注入染料，以确保没有气泡进入管中。
用生理盐水注射器替换葡聚糖注射器，并冲洗管子，直到管子中没有染料。取出针头，用纱布按压。注射氯胺酮甲苯胺酮甲苯胺酮麻醉进行成像。
将鼠标头固定在加热垫上，用牙科涂抹器清洁颅窗。将超声凝胶涂在窗口上，并通过双光子显微镜物镜聚焦。对于双光子成像，我们使用带有可调钛蓝宝石激光器的显微镜进行荧光，激发和光电倍增管进行发射检测。
在显微镜软件中，将波长设置为990纳米，以激发RCaMP和荧光素葡聚糖。接下来通过调整泡泡电池电压和PMT检测器灵敏度来设置激光功率。用这些参数和更高分辨率的实时扫描，可以看到RCaMP阳性壁画细胞和荧光标记的血浆。
建议采集深度堆栈，以正确定位血管网络中的周细胞。当聚焦在靠近PO血管的组织顶部时，将其设置为Zed系列堆栈的零点和顶部，然后在组织中向下聚焦到所需的深度并将其设置为堆栈的底部。必须调整激光功率，以随着显微镜在堆栈中移动得更深而增加。
在图像处理软件中打开Zed系列，将两个通道合并为彩色图像，并通过堆栈扫描感兴趣的周细胞和血管。选择包含周细胞的感兴趣区域并保存位置，以帮助在将来的成像会话中再次定位这些点。要收集和移动细胞周围钙事件，请将采集帧速率提高到每秒 10 帧以上。
将映像持续时间设置为 60 秒，并使用唯一的文件名更新保存路径。在容器上进行光学缩放以考虑较低的分辨率并获得近在咫尺的周视图。获取 T 系列。
要测量血管直径和红细胞速度，请选择线阵扫描以使用显微镜开始一维扫描。首先设置扫描的持续时间（以毫秒为单位）。然后画一条线，将感兴趣的船只一分为二，并沿着船只平行移动。
这将在左侧产生血管直径的运动记录仪和在右侧通过血管移动的红细胞条纹。有关此协议中使用的程序和包的完整列表，请参阅材料表。首先在图像处理软件中手动选择感兴趣的区域。
加载 T 系列文件，取堆栈的平均值，并制作彩色图像。选择面工具并勾勒出可见的护套周结构，例如体细胞和过程。为每个感兴趣的区域指定一个唯一的名称，并将它们另存为一个 zip 文件夹，稍后可以在编程软件中加载。
打开编程软件，确保图像处理包的文件夹位于路径上。将钙 T 系列导入编程软件，并定义每个通道上的内容。在这种情况下，它是通道1上的细胞信号和通道2上的血浆。
在编程软件中将数据绘制为电影，以便于可视化。为了从荧光素葡聚糖中去除渗入红色RCaMP通道的绿色荧光，请在图像处理包中取消混合通道。首先选择一个仅包含荧光团1的区域，在本例中为RCaMP。
其次选择一个仅含有荧光团2的区域，即血浆中的荧光素。最后选择一个没有荧光团的背景区域。这将生成一个光谱贡献矩阵，该矩阵应用于每个通道中的每个像素。
它显着改善了RCaMP信号的定位，这将增强对这些结构中钙事件的检测。在图像处理包中，有多种方法可以分析钙成像数据。首先对未混合的钙电影运行细胞信号传导分析，然后从zip文件夹中加载先前手动从周细胞中选择的感兴趣区域。
将比例因子设置为 1，因为不需要调整区域大小。处理后，生成每个 ROY 的绘图和不同颜色的归一化钙痕量。如果代码未检测到单个迹线中的大多数钙事件，则修改优化框中的内置参数，例如将短通滤波数据的阈值降低到基线周期标准偏差的三倍，这是 T 系列的前 30 帧。
为了检测和分类信号，归一化的钙迹线经过长通和带通滤波，这有助于平滑幅度和估计的数据，还可以确定信号是单峰，多峰还是平台。将数据输出为 CSV 文件，以进行进一步的统计分析。对未混合的钙感第二次运行细胞信号传导分析，并根据荧光在三维、X、Y 和时间中的活性和变化选择自动感兴趣区域识别。
绘制过程结果，查看所识别的感兴趣区域是不同颜色的。如果算法未检测到电影中肉眼清晰可见的 ROY，请修改内置参数，例如增加高斯滤波器以及时平滑数据，并将查找 ROY 的阈值降低到基线标准差的三倍。将 ROY 绘制为电影以进行进一步的可视化。
将数据输出为 CSV 文件，以进行进一步的统计分析。将线阵扫描运动记录仪数据文件导入编程软件，并定义每个通道上的内容。在线阵扫描上运行直径分析功能，这将打开一个框以选择与运动记录仪中的直径相对应的区域。
在运动记录仪荧光灯的边界之外画一个框，对应于血管直径。处理此数据类，以便测量容器直径最大值一半处的全宽并生成图解。接下来，在变换分析中运行速度速率，并在运动记录仪荧光灯的边界内绘制一个框。
处理此数据类以计算红细胞的速度、通量和线性密度。将血流结果输出为 CSV 文件，以便进一步分析。手工选择细胞结构可以检测这些区域内的钙波动，包括不同类型的信号峰，例如单峰和多峰，在归一化的钙痕量被低通和带通过滤之后。
此外，通过将活性像素组合在一起来识别感兴趣的区域，其中荧光的强度使用图像处理算法随时间变化。这可以通过调整时间、阈值和空间参数来包含信号的预期大小和形状，从而应用于任何动态蜂窝信号。降低信号识别的阈值会发现更多感兴趣的区域。
分析清晰的血流动力学运动记录仪，以测量鞘周围血管中的直径和红细胞速度。直径是从荧光灯最大值的一半处的全宽计算得出的。红细胞速度近似于由未标记的红细胞制成的条纹，其中角度被输入到氡变换中以计算速度。
质量差的运动记录仪，如果存在荧光饱和度，信噪比差或成像场的运动，会产生不可靠的图，其误差点指示为红叉，无法确定数据。获取的数据的质量对于获得良好的结果至关重要，遵循本协议中描述的步骤可确保获得良好的结果。在本视频中，我们概述了通过两个光子显微镜对脑鞘周围细胞进行钙成像和血流量测量的组合程序。
这些技术可用于解决有关脑血管网络内壁画细胞生理学和定位的问题，但它们可以用于研究大脑或其他器官系统中任何细胞类型中的钙瞬变。
