La vasculatura cerebral es una red compleja de arterias penetrantes, capilares y vénulas ascendentes. Estos vasos están encerrados por células murales, como los pericitos de envainamiento, que expresan actina del músculo liso alfa, y se encuentran dentro de las primeras cuatro ramas de las arterias penetrantes. Utilizamos ratones transgénicos Acta2-RCaMP 1.07, para visualizar transitorios de calcio en estas células, a través de la expresión del indicador de calcio codificado genéticamente RCaMP.
El calcio juega un papel importante en la contracción de estas células y el control del flujo sanguíneo. Los pericitos capilares se encuentran más abajo en la red vascular y se pueden etiquetar en otros modelos transgénicos. Sin embargo, nos centramos en ensalar los pericitos en este método.
Nuestros ratones han sido implantados quirúrgicamente con una ventana craneal crónica que permite el acceso a la vasculatura cerebral para obtener imágenes. Aquí, describimos los pasos de preparación necesarios y la inyección de la vena de la cola seguida de las dos imágenes de fotones y los métodos analíticos necesarios para adquirir datos de calcio pericitario e información sobre el flujo sanguíneo en animales anestesiados. Los siguientes elementos son necesarios para una inyección de catéter de la vena de la cola: jeringas de insulina, una pieza de tubo de PE10 de 15 centímetros, agujas de calibre 30, gasa, solución salina, fórceps, tinte de fluoresceína dextrano verde, alicates y tijeras.
También tenemos una aguja con anestesia de ketamina xilazina que inyectaremos antes de la toma de imágenes, ya que es mejor que el isoflurano para las mediciones del flujo sanguíneo. Usando los alicates, rompa una aguja de calibre 30 del cubo. Inserte cuidadosamente la aguja en el extremo de la pieza de tubo de PE10 unida a una jeringa llena de solución salina.
Este es el catéter para inyección. Anestesiar un ratón con isoflurano y aplicar gel I-Lube. Coloque un campo de guantes con agua tibia en la cola para dilatar la vena lateral.
Después de limpiar la cola con etanol, inserte la aguja en la vena e inyecte suavemente solución salina a través del catéter para asegurarse de que la aguja se coloque correctamente. Cambie la jeringa del catéter por una jeringa llena de colorante de fluoresceína dextrano. Inyecte lentamente el tinte para asegurarse de que no entren burbujas en el tubo.
Reemplace la jeringa de dextrano con la jeringa de solución salina y enjuague el tubo hasta que no quede ningún tinte en el tubo. Retire la aguja y presione con una gasa. Inyecte anestesia con ketamina xilazina para obtener imágenes.
Con la cabeza del ratón fija en una almohadilla térmica, limpie la ventana craneal con aplicadores dentales. Aplique gel de ultrasonido en la ventana y enfoque a través del objetivo del microscopio de dos fotones. Para la obtención de imágenes de dos fotones, utilizamos un microscopio con láser de zafiro de titanio sintonizable para fluorescentes, excitación y tubos fotomultiplicadores para la detección de emisiones.
En el software del microscopio, ajuste la longitud de onda a 990 nanómetros para excitar tanto el RCaMP como la fluoresceína dextrano. A continuación, ajuste la potencia del láser ajustando el voltaje de la celda pockel y la sensibilidad del detector PMT. Escaneo en vivo con estos parámetros y mayor resolución, se pueden ver células murales RCaMP positivas y el plasma sanguíneo etiquetado fluorescentemente.
Se recomienda la adquisición de una pila de profundidad para localizar adecuadamente los pericitos en la red vascular. Cuando se enfoca en la parte superior del tejido cerca de los vasos PO, establezca esto como el punto cero y la parte superior de la pila de la serie Zed, luego concéntrese hacia abajo en el tejido a la profundidad deseada y establezca esto como la parte inferior de la pila. La potencia del láser debe ajustarse para aumentar a medida que el microscopio se mueve más profundamente a través de la pila.
Al abrir la serie Zed en el software de procesamiento de imágenes, fusione los dos canales como imágenes coloreadas y escanee a través de la pila en busca de pericitos y vasos sanguíneos de interés. Seleccione las regiones de interés que contienen pericitos y guarde las posiciones para ayudar a localizar estos puntos nuevamente en futuras sesiones de imágenes. Para recolectar y mover un evento de calcio pericito, aumente la velocidad de fotogramas de adquisición a más de 10 fotogramas por segundo.
Establezca la duración de la imagen en 60 segundos y actualice la ruta de guardado con un nombre de archivo único. Haga zoom ópticamente en el vaso para tener en cuenta la resolución más baja y obtener una vista más cercana del pericito. Adquiere la serie T.
Para medir el diámetro de los vasos sanguíneos y la velocidad de los glóbulos rojos, seleccione la exploración de línea para iniciar una exploración unidimensional con el microscopio. Primero establezca la duración del escaneo en milisegundos. Luego dibuje una línea que divida el recipiente de interés y se mueva paralelo a lo largo del recipiente.
Esto generará un kymograph del diámetro del vaso a la izquierda y rayas de los glóbulos rojos que se mueven a través del vaso a la derecha. Consulte la tabla de materiales para obtener una lista completa de los programas y paquetes utilizados en este protocolo. Primero seleccione las regiones de interés a mano en el software de procesamiento de imágenes.
Cargue el archivo de la serie T, tome el promedio de la pila y haga una imagen coloreada. Seleccione la herramienta de polígono y delinee las estructuras de pericitos de envainamiento visible, como el soma y los procesos. Asigne a cada región de interés un nombre único y guárdelos como una carpeta zip que se puede cargar más adelante en el software de programación.
Abra el software de programación y asegúrese de que las carpetas de los paquetes de procesamiento de imágenes estén en la ruta. Importe la serie T de calcio en el software de programación y defina lo que hay en cada canal. En este caso, es una señal celular en el canal uno y plasma sanguíneo en el canal dos.
Traza los datos como una película dentro del software de programación para facilitar la visualización. Para eliminar los fluorescentes verdes del dextrano de fluoresceína que sangra en el canal RCaMP rojo, des mezcle los canales en el paquete de procesamiento de imágenes. Primero seleccione una región que solo contenga fluoróforo 1, RCaMP en este caso.
En segundo lugar, seleccione una región que solo contenga fluoróforo 2, fluoresceína en el plasma. Finalmente seleccione un área de fondo que no tenga ninguno de los fluoróforos. Esto genera una matriz de contribución espectral, que se aplica a cada píxel en cada canal.
Mejora significativamente la localización de la señal RCaMP, lo que mejorará la detección de eventos de calcio en estas estructuras. Hay múltiples formas en que los datos de imágenes de calcio se pueden analizar dentro de los paquetes de procesamiento de imágenes. Primero ejecute el análisis de señalización celular en la película de calcio sin mezclar y cargue las regiones de interés de la carpeta zip que se seleccionaron de los pericitos a mano anteriormente.
Establezca el factor de escala en uno porque no es necesario cambiar el tamaño de las regiones. Después del procesamiento, genere gráficos de cada ROY y los rastros de calcio normalizados en diferentes colores. Si el código no detecta la mayoría de los eventos de calcio en las trazas individuales, modifique los parámetros integrados dentro del cuadro de optimización, como disminuir el umbral para los datos filtrados de paso corto a tres veces la desviación estándar del período de referencia, que son los primeros 30 fotogramas de la serie T.
Para detectar y clasificar las señales, la traza de calcio normalizada es de paso largo y paso de banda filtrada, lo que ayuda a suavizar los datos de amplitud y con estimaciones, pero también a determinar si las señales son picos individuales, picos múltiples o mesetas. Genere los datos como un archivo CSV para un análisis estadístico adicional. Ejecute el análisis de señalización celular por segunda vez en la película de calcio sin mezclar y seleccione la identificación automatizada de la región de interés en función de la actividad y el cambio en los fluorescentes en tres dimensiones, X, Y y tiempo.
Trazar los resultados del proceso para ver las regiones de interés identificadas en diferentes colores. Si el algoritmo no detecta ROYs que son claramente visibles a simple vista en la película, modifique los parámetros incorporados, como aumentar el filtro gaussiano que suaviza los datos en el tiempo y disminuir el umbral para encontrar ROYs a tres veces la desviación estándar de la línea de base. Traza los ROYs como una película para una mayor visualización.
Genere los datos como un archivo CSV para un análisis estadístico adicional. Importe el archivo de datos kymograph de escaneo de línea en el software de programación y defina lo que hay en cada canal. Ejecute la función de análisis de diámetro en el escaneo de línea, que abre un cuadro para seleccionar el área que corresponde al diámetro en el kymograph.
Dibuje una caja fuera de los límites de los fluorescentes del kymograph, que corresponda al diámetro del vaso. Procese esta clase de datos para medir el ancho completo a la mitad de los máximos para el diámetro del recipiente y genere una gráfica. A continuación, ejecute la tasa de velocidad en el análisis de transformación y dibuje una caja dentro del borde de los fluorescentes kymograph.
Procese esta clase de datos para calcular la velocidad, el flujo y la densidad lineal de los glóbulos rojos. Genere los resultados del flujo sanguíneo como un archivo CSV para su posterior análisis. La selección manual de estructuras celulares permite la detección de fluctuaciones de calcio dentro de estas regiones, incluidos diferentes tipos de picos de señal, como picos individuales y picos múltiples, después de que los rastros de calcio normalizados se filtran de paso bajo y paso de banda.
Además, las regiones de interés se identifican agrupando píxeles activos donde la intensidad de los fluorescentes cambia con el tiempo utilizando algoritmos de procesamiento de imágenes. Esto se puede aplicar a cualquier señal celular dinámica ajustando el tiempo, el umbral y los parámetros espaciales para abarcar el tamaño y la forma esperados de la señal. La disminución del umbral para la identificación de señales encuentra más regiones de interés.
Los quimógrafos hemodinámicos claros se analizan para medir el diámetro y la velocidad de los glóbulos rojos en los vasos sanguíneos cerca de los pericitos que se envuelven. El diámetro se calcula a partir del ancho total a la mitad del máximo de los fluorescentes. La velocidad de los glóbulos rojos se aproxima a partir de las rayas hechas de glóbulos rojos no etiquetados, donde el ángulo se introduce en una transformación de radón para calcular la velocidad.
Los kymographs de mala calidad, donde hay saturación fluorescente, mala relación señal-ruido o movimiento del campo de imágenes, crean gráficos poco confiables con puntos de error, indicados como cruces rojas, donde no se pueden determinar los datos. La calidad de los datos adquiridos es fundamental para un buen resultado y seguir los pasos descritos en este protocolo asegura buenos resultados. En este video, describimos el procedimiento para la combinación de imágenes de calcio de pericitos de envainamiento cerebral y mediciones de flujo sanguíneo mediante microscopía de dos fotones.
Estas técnicas son útiles para abordar preguntas sobre la fisiología de las células murales y la localización dentro de la red vascular cerebral, pero se pueden adaptar para estudiar los transitorios de calcio en cualquier tipo de célula en el cerebro u otro sistema de órganos.
