Este método de coculto ayudará a responder preguntas clave sobre los mecanismos de contacto celular detrás de la regulación de las células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos y, por lo tanto, iluminará el papel de MSC en la regulación de la inmunidad innata. Esta técnica se puede aplicar en análisis de alto rendimiento. Las biopartículas conjugadas con colorantes sensibles al pH fluorescencia solo en ambientes de faglisosomas ácidos.
Por lo tanto, el lavado y el enfriamiento son necesarios. Este método también se puede aplicar a una variedad de modelos de coculto que incluyen neutrófilos y otros fagocitos. Demostrando el procedimiento estará Ethan Chetkof, un estudiante universitario actualmente en mi laboratorio.
Para empezar, observe la confluencia de células madre mesenquimales cultivadas. Cuando se alcanza una confluencia del 70-80%, aspire el medio de crecimiento de las células cultivadas en un plato de 100 milímetros y agregue cinco mililitros de PBS. Después de aspirar el PBS, agregue dos mililitros de solución de EDTA de tripsina al 0,05% e incube las células durante tres minutos.
Después de tres minutos, verifique el desprendimiento celular con un microscopio invertido. Y si las células no están separadas, incube durante uno o dos minutos nuevamente. Una vez que todas las células estén separadas, agregue cinco mililitros de medio de crecimiento fresco a la placa.
Después de enjuagar la placa con la mezcla de medio de tripsina, use una pipeta serológica estéril para recolectar células en un tubo cónico limpio y estéril de 50 mililitros. A continuación, peletizar las células por centrifugación. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a colocar la gránula celular en 10 mililitros de medio de crecimiento fresco mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo.
Para el conteo celular, agregue 10 microlitros de suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros que contenga 30 microlitros de solución de Trypan Blue al 0.4%, luego agregue 10 microlitros de la mezcla debajo de la cubierta de una cámara de conteo del hemocitómetro. Bajo el microscopio invertido o Brightfield, cuente las células viables no teñidas utilizando una lente de objetivo 10X y cuatro cámaras de un milímetro cuadrado y calcule el número de células como se describe en el manuscrito de texto. Utilice la ecuación C1V1 igual a C2V2 para determinar el volumen deseado del medio fresco y la suspensión celular necesaria para preparar la suspensión celular a una concentración final de una vez 10 a la quinta célula por mililitro.
Use un micropipetador multicanal para agregar 100 microlitros de la suspensión celular en los pozos de una placa de 96 pozos de acuerdo con el diseño de la placa. Use una micropipeta para agregar 530 microlitros de la suspensión celular a cada uno de los portaobjetos de la cámara de acuerdo con el diseño de la placa e incube durante la noche. Preparar 10 mililitros de medio de activación que contenga interferón gamma a una concentración de 250 nanogramos por mililitro para activar las células de macrófagos en un plato de 100 milímetros.
Aspire el medio de crecimiento de los cultivos de células macrófagos y enjuague las células con cinco mililitros del medio de activación desprovisto de interferón gamma. Después de aspirar el medio de enjuague en el plato experimental, agregue 10 mililitros de medio de activación suplementado con interferón gamma. Y en el plato de control, agregue 10 mililitros de medio de activación sin interferón gamma, luego incube las células durante 16 a 24 horas.
Al final de la incubación, para preparar los cocultivos, retire el medio de activación de las células de macrófagos y agregue cinco mililitros de medio de crecimiento fresco. Use un elevador de células para raspar suavemente las células y recolectar las células en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, cuente las células utilizando la exclusión de Trypan Blue y la hemocitometría, seguida de la preparación de suspensiones de células macrófagos de control y tratadas a la concentración de dos veces 10 a la quinta célula por mililitro como se demostró previamente para las células madre mesenquimales.
Aspire suavemente el medio de los pozos experimentales que contienen células madre mesenquimales. Utilice una micropipeta multicanal para agregar 100 microlitros de las suspensiones de células de macrófagos tratadas y de control en los pozos experimentales apropiados de acuerdo con el diseño de la placa e incube durante la noche como se ha demostrado. Aspire suavemente el medio desde el portaobjetos de cámara de cuatro paredes que contiene células madre mesenquimales.
Use una micropipeta para agregar 530 microlitros de la suspensión de células de macrófagos a los pozos apropiados de acuerdo con el diseño e incube durante la noche. Agregue un mililitro de medio de imágenes de células vivas al vial que contiene un miligramo de partículas de Zymosan y recoja la mezcla de partículas de medio en un tubo de cultivo de vidrio. Después de enjuagar el vial con un mililitro adicional de solución de imágenes, transfiera el medio de imágenes enjuagado en el tubo de vidrio, luego agregue tres mililitros de solución de imágenes adicional para lograr 0.2 miligramos por mililitro de suspensión de partículas de Zymosan.
Vórtice la suspensión Zymosan usando pulsos rápidos durante 30 a 60 segundos, luego use un sonicador de sonda para sonicar la suspensión con 60 pulsos rápidos. Después de aspirar el medio, enjuague los pozos experimentales y los pozos en blanco del reactivo con 100 microlitros de solución de imágenes de células vivas. A continuación, aspire la solución de imágenes de células vivas de los pozos y agregue 100 microlitros de la suspensión de Zymosan.
Abra la bandeja de placas del lector fluorescente utilizando la interfaz del panel táctil. Coloca la placa sin la tapa en la bandeja con el pozo A1 en la esquina superior izquierda. Cierre la bandeja con el panel táctil y haga clic en el botón verde de lectura en el menú superior.
Para realizar el ensayo de fagocitosis, después de enjuagar el primer pozo experimental con 750 microlitros del medio de imagen, agregue 400 microlitros de la suspensión de Zymosan dejando los pozos restantes en el medio de crecimiento. A continuación, coloque la diapositiva en la etapa incubada del sistema de imágenes. Utilice el software de imágenes.
Seleccione la opción Campo brillante en la pestaña Localizar y, a continuación, haga clic en el icono del ocular. Con el objetivo 10X en su lugar, use el ocular y la perilla de enfoque para enfocar las células. Seleccione la pestaña de adquisición.
Abra el menú desplegable del experimento y seleccione un conjunto de longitudes de onda que incluya el conjunto de filtros EGFP para acomodar la excitación de 509 nanómetros y las longitudes de onda de emisión de 533 nanómetros del tinte sensible al pH. Cuando queden unos dos minutos en el temporizador, haga clic en el icono 20X en el menú del objetivo para cambiar el objetivo a 20X, luego haga clic en el menú de canales, seleccione filtros EGFP y, en el menú de exposición, establezca el tiempo de exposición en 400 milisegundos para detectar el fluoróforo verde sensible al pH, y luego haga clic en en vivo. Después de ajustar el enfoque, haga clic en detener para apagar la luz y marque la casilla junto a la configuración experimental de lapso de tiempo superior.
En el menú de estrategia de enfoque, seleccione el enfoque automático del software y, en el menú desplegable, seleccione la configuración inteligente y central para reducir el tiempo de exposición a la luz mientras se ejecuta el enfoque automático. En el menú de lapso de tiempo, establezca el número deseado de adquisiciones en 30 a 60, el tiempo de intervalo en un minuto y luego haga clic en el botón Iniciar experimento para comenzar la adquisición. Se estudió el efecto del interferón gamma sobre el coculto.
Los resultados representativos demuestran que el coculto de macrófagos con células madre mesenquimales mejora la actividad fagocítica del macrófago. El tratamiento con interferón gamma reduce la actividad del macrófago. Sin embargo, en presencia de células madre mesenquimales, la actividad fagocítica de los macrófagos fue parcialmente rescatada.
Las densidades celulares óptimas son críticas en estos estudios. Y cuando las células de macrófagos se cubrieron a una densidad demasiado baja, no se detectaron cambios en la intensidad de la fluorescencia. Cuando las células macrófagos se colocaron en una alta densidad, la intensidad de la fluorescencia se elevó rápidamente en todos los grupos y no se discernieron diferencias.
Una de las cosas más importantes durante este procedimiento es asegurarse de que las densidades celulares se optimicen y se mantengan consistentes entre los experimentos.
