Этот метод кокультуры поможет ответить на ключевые вопросы, связанные с механизмами контакта с клетками, лежащими в основе регуляции мезенхимальных стволовых клеток фагоцитоза макрофагов, и, следовательно, пролить свет на роль MSC в регуляции врожденного иммунитета. Этот метод может быть применен в высокопроизводительных анализах. Биочастицы, конъюгированные с pH-чувствительными красителями, флуоресцируют только в кислых фаголизосомных средах.
Следовательно, мытье и закалка необходимы. Этот метод также может быть применен к различным моделям кокультур, которые включают нейтрофилы и другие фагоциты. Продемонстрировать процедуру будет Итан Четкоф, студент, который в настоящее время находится в моей лаборатории.
Для начала понаблюдайте за слиянием культивированных мезенхимальных стволовых клеток. Когда достигается 70-80% слияние, аспирируют питательную среду из культивированных клеток в 100-миллиметровую чашку и добавляют пять миллилитров PBS. После аспирации PBS добавляют два миллилитра 0,05% раствора трипсина ЭДТА и инкубируют клетки в течение трех минут.
Через три минуты проверьте отслоение клеток с помощью перевернутого микроскопа. А если клетки не отделились, снова высиживают в течение одной-двух минут. Как только все клетки отсоединятся, добавьте пять миллилитров свежей питательной среды к пластине.
После промывки пластины с использованием смеси трипсиновой среды используйте стерильную серологическую пипетку для сбора клеток в чистую, стерильную коническую трубку размером 50 миллилитров. Затем гранулируют клетки центрифугированием. После аспирации супернатанта повторно суспендируют клеточную гранулу в 10 миллилитрах свежей питательной среды, осторожно пипетируя вверх и вниз.
Для подсчета клеток добавляют 10 микролитров клеточной суспензии в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую 30 микролитров 0,4% раствора Trypan Blue, затем добавляют 10 микролитров смеси под крышкой счетной камеры гемоцитометра. Под инвертированной или Brightfield микроскопом подсчитайте незапятнанные жизнеспособные клетки, используя объектив 10X и четыре камеры в один квадратный миллиметр, и вычислите число клеток, как описано в текстовой рукописи. Используйте уравнение C1V1, равное C2V2, чтобы определить желаемый объем свежей среды и клеточной суспензии, необходимый для приготовления клеточной суспензии в конечной концентрации от одного раза 10 до пятой клетки на миллилитр.
Используйте многоканальный микропипеттер для добавления 100 микролитров клеточной суспензии в колодцы 96-луночной пластины в соответствии с конструкцией пластины. Используйте микропипетку, чтобы добавить 530 микролитров клеточной суспензии к каждому слайду камеры в соответствии с конструкцией пластины и инкубировать в течение ночи. Готовят 10 миллилитров активационной среды, содержащей интерферон гамма в концентрации 250 нанограмм на миллилитр для активации клеток макрофагов в одной 100-миллиметровой чашке.
Аспирировать питательную среду из культур клеток макрофагов и промыть клетки пятью миллилитрами активационной среды, лишенной интерферона гамма. После аспирации промывной среды в экспериментальной посуде добавляют 10 миллилитров активационной среды, дополненной интерфероном гамма. А в контрольную чашку добавить 10 миллилитров активационной среды без интерферона гамма, затем инкубировать клетки в течение 16 - 24 часов.
В конце инкубации для приготовления кокультур удаляют активационную среду из клеток макрофагов и добавляют пять миллилитров свежей питательной среды. Используйте клеточный лифтер, чтобы аккуратно соскоблить клетки и собрать клетки в коническую трубку размером 50 миллилитров. Далее подсчитывают клетки с помощью трипан-синего исключения и гемоцитометрии с последующим приготовлением контрольных и обработанных суспензий клеток макрофагов в концентрации от двух раз 10 до пятой клетки на миллилитр, как показано ранее для мезенхимальных стволовых клеток.
Осторожно аспирировать среду из экспериментальных скважин, содержащих мезенхимальные стволовые клетки. Используйте многоканальный микропипетку для добавления 100 микролитров обработанных и контрольных суспензий макрофагов в соответствующие экспериментальные скважины в соответствии с конструкцией пластины и инкубируйте в течение ночи, как показано на демонстрации. Осторожно аспирируйте среду из четырехстенного камерного слайда, содержащего мезенхимальные стволовые клетки.
Используйте микропипетку, чтобы добавить 530 микролитров клеточной суспензии макрофага в соответствующие лунки в соответствии с конструкцией и инкубировать в течение ночи. Добавьте один миллилитр среды визуализации живых клеток во флакон, содержащий один миллиграмм частиц зимозана, и соберите смесь частиц среды в стеклянную культуральную трубку. После промывки флакона дополнительным одним миллилитрами раствора для визуализации перенесите промытую среду визуализации в стеклянную трубку, затем добавьте три миллилитра дополнительного раствора для визуализации для достижения 0,2 миллиграмма на миллилитр суспензии частиц Зимозана.
Вихрь подвески Zymosan с использованием быстрых импульсов в течение 30-60 секунд, затем используйте зондовый ультразвуковой аппарат для обшивки суспензии с помощью 60 быстрых импульсов. После аспирации среды промыть экспериментальные скважины и заготовки реагентов 100 микролитрами раствора для визуализации живых клеток. Затем аспирируют раствор для визуализации живых клеток из скважин и добавляют 100 микролитров суспензии Zymosan.
Откройте лоток пластин флуоресцентного считывателя с помощью интерфейса сенсорной панели. Установите тарелку без крышки в лоток с колодец А1 в левом верхнем углу. Закройте лоток с помощью сенсорной панели и нажмите на зеленую кнопку чтения в верхнем меню.
Для проведения анализа фагоцитоза после промывки первой экспериментальной скважины 750 микролитрами среды визуализации добавляют 400 микролитров суспензии Зимозана, оставляя оставшиеся лунки в питательной среде. Затем поместите слайд на инкубированную стадию системы визуализации. Используйте программное обеспечение для создания образов.
Выберите опцию Brightfield на вкладке «Найти», а затем нажмите на значок окуляра. С целью 10X на месте используйте окуляр и ручку фокусировки, чтобы сосредоточиться на ячейках. Выберите вкладку приобретения.
Откройте раскрывающееся меню эксперимента и выберите набор длин волн, который включает в себя фильтр EGFP, который вмещает возбуждение 509 нанометров и длины волн излучения 533 нанометра pH-чувствительного красителя. Когда на таймере останется около двух минут, нажмите на значок 20X в меню цели, чтобы изменить цель на 20X, затем нажмите на меню каналов, выберите фильтры EGFP и в меню экспозиции установите время экспозиции на 400 миллисекунд, чтобы обнаружить чувствительный к pH зеленый флуорофор, а затем нажмите на live. После настройки фокуса нажмите на остановку, чтобы выключить свет, и установите флажок рядом с верхней экспериментальной настройкой замедленной съемки.
В меню стратегии фокусировки выберите программную автофокусировку и в раскрывающемся меню выберите интеллектуальные и основные настройки, чтобы сократить время воздействия света во время работы автофокуса. В покадровом меню установите желаемое количество приобретений от 30 до 60, интервал времени до одной минуты, а затем нажмите кнопку начать эксперимент, чтобы начать приобретение. Изучено влияние интерферона гамма на кокультуру.
Репрезентативные результаты показывают, что кокультура макрофагов с мезенхимальными стволовыми клетками усиливает фагоцитарную активность макрофага. Лечение интерфероном гамма снижает активность макрофага. Однако в присутствии мезенхимальных стволовых клеток фагоцитарная активность макрофагов была частично спасена.
Оптимальная плотность клеток имеет решающее значение в этих исследованиях. И когда клетки макрофагов были покрыты слишком низкой плотностью, изменения интенсивности флуоресценции не были обнаружены. Когда клетки макрофагов были покрыты высокой плотностью, интенсивность флуоресценции быстро повышалась во всех группах, и различия не были выявлены.
Одной из наиболее важных вещей во время этой процедуры является обеспечение того, чтобы плотности клеток были оптимизированы и поддерживались в соответствии между экспериментами.
