שיטת תרבות משותפת זו תסייע לענות על שאלות מרכזיות סביב מנגנוני הקשר לתאים מאחורי ויסות תאי גזע מזנכימליים של פאגוציטוזיס מקרופאגים, ולכן להאיר את תפקידו של MSC בוויסות חסינות מולדת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת ניתוחים בעלי תפוקה גבוהה. החלקיקים הביולוגיים מצומדים לצבעים רגישים ל-pH פלואורסצ'ה רק בסביבות פאגוליסום חומציות.
לפיכך, יש צורך בשטיפה ובהרווים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על מגוון מודלים של תרבות משותפת הכוללים נויטרופילים ופגוציטים אחרים. מדגים את ההליך יהיה איתן Chetkof, תואר ראשון כרגע במעבדה שלי.
ראשית, שימו לב למפגש של תאי גזע מזנכימליים בתרבית. כאשר 70-80% השפעה מושגת, לשאוף את מדיום הצמיחה מן התאים התרבותיים בצלחת 100 מ"מ ולהוסיף חמישה מיליליטר של PBS. לאחר שאיפה PBS, להוסיף שני מיליליטר של 0.05%טריפסין פתרון EDTA ולדגירה על התאים במשך שלוש דקות.
לאחר שלוש דקות, בדוק את ניתוק התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך. ואם התאים אינם מנותקים, דגירה במשך 1 עד 2 דקות שוב. לאחר כל התאים מנותקים, להוסיף חמישה מיליליטר של מדיום צמיחה טרי לצלחת.
לאחר שטיפה של הצלחת באמצעות תערובת טריפסין בינונית, להשתמש פיפטה סרולוגית סטרילית כדי לאסוף תאים לתוך צינור חרוט נקי, סטריליטר 50 מיליליטר. לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר שאיפת supernatant, resuspend גלולה התא ב 10 מיליליטר של מדיום צמיחה טרי על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה.
לספירת תאים, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של השעיית תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל 30 מיקרוליטרים של תמיסת טריפן כחולה 0.4%, ולאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של התערובת מתחת לכיסוי של תא ספירת המוציטומטר. תחת המיקרוסקופ ההפוך או ברייטפילד, ספר את התאים הקיימים שאינם נגועים באמצעות עדשה אובייקטיבית של פי 10 וארבעה תאים של מילימטר מרובע אחד וחשב את מספר התא כמתואר בכתב היד של הטקסט. השתמש במשוואה C1V1 שווה C2V2 כדי לקבוע את הנפח הרצוי של המתלים הבינוניים והתאים הטריים הנדרשים להכנת השעיית התא בריכוז סופי של פעם אחת כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר.
השתמש micropipetter רב ערוצית כדי להוסיף 100 microliters של השעיית התא בבארות של צלחת 96-well על פי עיצוב הצלחת. השתמש micropipette כדי להוסיף 530 microliters של השעיית התא לכל שקופית התא על פי עיצוב הצלחת ודגורה לילה. הכן 10 מיליליטר של אמצעי הפעלה המכיל גמא אינטרפרון בריכוז של 250 ננוגרם למיליליטר להפעלת תאי המקרופאג 'בצלחת אחת 100 מ"מ.
שאפו את מדיום הצמיחה מתרביות תאי המקרופאג' ושטפו את התאים בחמישה מיליליטר של אמצעי ההפעלה נטולי אינטרפרון גמא. לאחר שאיפה מדיום שטיפה בצלחת ניסיונית, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום הפעלה בתוספת אינטרפרון גמא. ובצלחת הבקרה, להוסיף 10 מיליליטר של מדיום הפעלה ללא אינטרפרון גמא, ולאחר מכן לדגור על התאים במשך 16 עד 24 שעות.
בסוף הדגירה, להכנת תרביות משותפות, להסיר את מדיום ההפעלה מתאי המקרופאגים ולהוסיף חמישה מיליליטר של מדיום צמיחה טרי. השתמש מרים תאים בעדינות לגרד את התאים ולאסוף את התאים לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. לאחר מכן, לספור את התאים באמצעות החרגת כחול טריפן והמוציטומטריה, ואחריו הכנת שליטה ומטופלים השעיות תא מקרופאג בריכוז של פעמיים 10 עד התא החמישי למיליליטר כפי שהודגם בעבר עבור תאי גזע mesenchymal.
שאפו בעדינות את המדיום מהבארות הניסיוניות המכילות תאי גזע מזנכימליים. השתמש micropipette רב ערוצית כדי להוסיף 100 microliters של מטופלים ואת התליות תא מקרופאג 'בקרה בבארות הניסוי המתאימות על פי עיצוב הצלחת ודגורה לילה כפי שהוכח. שאפו בעדינות את המדיום מהמגלשה התאית בעלת ארבעת החומות המכילה תאי גזע מזנכימליים.
השתמש micropipette כדי להוסיף 530 microliters של השעיית תא מקרופאג לבארות המתאימות על פי העיצוב ודגרה בן לילה. הוסף מיליליטר אחד של מדיום הדמיה של תאים חיים ל בקבוקון המכיל מיליגרם אחד של חלקיקי זימוסאן ולאסוף את תערובת החלקיקים הבינוני לתוך צינור תרבות זכוכית. לאחר שטיפה של בקבוקון עם מיליליטר נוסף של פתרון הדמיה, להעביר את מדיום הדמיה שטוף בצינור הזכוכית, ולאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של פתרון הדמיה נוסף כדי להשיג 0.2 מיליגרם לכל השעיית חלקיקים זימוסאן מיליליטר.
מערבולת השעיית זימוסאן באמצעות פולסים מהירים במשך 30 עד 60 שניות, ולאחר מכן להשתמש sonicator בדיקה כדי sonicate ההשעיה עם 60 פולסים מהירים. לאחר שאיפת המדיום, לשטוף את הבארות הניסיוניות ובארות ריקות ריאגנט עם 100 microliters של פתרון הדמיית תאים חיים. לאחר מכן, שאפו את פתרון הדמיית התא החי מהבארות והוסיפו 100 מיקרוליטרים של ההשעיה הזימוסאית.
פתח את מגש הלוחות של קורא הפלואורסצנטי באמצעות ממשק משטח המגע. הגדר את הצלחת ללא המכסה במגש עם הבאר A1 בפינה השמאלית העליונה. סגור את המגש באמצעות משטח המגע ולחץ על לחצן הקריאה הירוק בתפריט העליון.
כדי לערוך את בדיקות phagocytosis, לאחר שטיפה הבאר הניסיונית הראשונה עם 750 microliters של מדיום הדמיה, להוסיף 400 microliters של השעיית זימוסאן עוזב את הבארות הנותרות במדיום הצמיחה. לאחר מכן, הנח את השקופית על השלב הדגירה של מערכת ההדמיה. השתמש בתוכנת ההדמיה.
בחר באפשרות ברייטפילד תחת הכרטיסיה איתור ולאחר מכן לחץ על סמל העין. עם המטרה 10X במקום, להשתמש בעין ואת הידית התמקדות להתמקד בתאים. בחר את הכרטיסיה רכישה.
פתחו את התפריט הנפתח של הניסוי ובחרו קבוצה של אורכי גל הכוללים מסנן EGFP המוגדר להכיל עירור של 509 ננומטר ואורכי גל פליטה של 533 ננומטר של הצבע הרגיש ל- pH. כאשר נותרו כשתי דקות על הטיימר, לחץ על סמל 20X בתפריט האובייקטיבי כדי לשנות את המטרה ל- 20X, ולאחר מכן לחץ על תפריט הערוצים, בחר מסנני EGFP ובתפריט החשיפה, הגדר את זמן החשיפה ל - 400 אלפיות השנייה כדי לזהות את הפלורופור הירוק הרגיש ל- pH ולאחר מכן לחץ על חי. לאחר התאמת המוקד, לחץ על עצור כדי לכבות את האור וסמן את התיבה לצד ההגדרה הניסיונית העליונה של זמן לשגות.
בתפריט אסטרטגיית המיקוד, בחר מיקוד אוטומטי של התוכנה ומהתפריט הנפתח, בחר הגדרות חכמות וליבה כדי לקצר את זמן החשיפה לאור בזמן שהמיקוד האוטומטי פועל. בתפריט זמן-לשגות, הגדר את מספר הרכישות הרצוי ל- 30 עד 60, את זמן המרווח לדקה אחת ולאחר מכן לחץ על לחצן התחל ניסוי כדי להתחיל את הרכישה. ההשפעה של אינטרפרון גמא על התרבות המשותפת נחקרה.
התוצאות הייצוגיות מראות כי התרבות המשותפת של מקרופאגים עם תאי גזע מזנכימליים משפרת את הפעילות הפגוציטית של המקרופאג'. טיפול אינטרפרון גמא מפחית את הפעילות של המקרופאג'. עם זאת, בנוכחות תאי גזע מזנכימליים, הפעילות הפגוציטית המקרופאג' חולצה חלקית.
צפיפות התאים האופטימלית היא קריטית במחקרים אלה. וכאשר תאי המקרופאגים היו מצופים בצפיפות נמוכה מדי, לא זוהו שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות. כאשר תאי המקרופאגים היו מצופים בצפיפות גבוהה, עוצמת הפלואורסצנטיות הועלתה במהירות בכל הקבוצות ולא הבחינו בהבדלים.
אחד הדברים החשובים ביותר במהלך הליך זה הוא להבטיח כי צפיפות התאים הם אופטימיזציה ונשמר עקבי בין ניסויים.
