يوفر هذا البروتوكول طريقة بديلة في الجسم الحي لدراسة دور نمو الورم للضربة القاضية الجينية القاتلة الجنينية. ميزة هذه الطريقة هي أن الضربات القاضية الجينية التي عادة ما تكون قاتلة جنينيا يمكن إجراؤها في الأورام المستمدة من نموذج فأر مهندس وراثيا لدراسة فقدانها لتأثيرات الوظيفة في الجسم الحي. يمكن تطبيق هذه التقنية على الأمراض التي تتطلب دراسة الدور الحي للجينات الأساسية الجنينية التي لا يمكن تحقيقها من نماذج الفئران التقليدية بالضربة القاضية للجينات.
يستغرق إنشاء النموذج الحيواني وقتا طويلا ويلزم إجراء اختبارات تجريبية لتحديد وزارة الداخلية المثلى للعدوى الفيروسية الغدية لضمان تحقيق إعادة التركيب المناسبة. بادئ ذي بدء ، حدد الماوس مع النمط الوراثي المطلوب. عندما يصل الفأر الحامل للورم إلى نقطة نهايته الإنسانية ، قم بالقتل الرحيم للفأر واستخدم سكين مشرط معقم لإزالة الورم.
قم بتشريح الورم إلى ثلاثة أقسام في قطع على غرار رغيف الخبز باستخدام سكين مشرط لتوليد شرائح الأنسجة لتثبيت الفورمالين البارافين الذي يتضمن توليد ثقافة المرور المبكر والتجميد السريع للتحليلات التحليلية. قم بتلطيخ قسم أنسجة بسمك خمسة ميكرومترات من الفورمالين الثابت والبارافين مع الهيماتوكسيلين والإيوزين. بمجرد أن يؤكد أخصائي علم الأمراض الورم ، قم بإجراء تلطيخ المناعة النسيجية الكيميائية لتأكيد تشخيص الورم.
ضع نسيج ورم غمد الأعصاب المحيطية الخبيث الذي تم جمعه حديثا في 10 ملليلتر من PBS المعقم على الجليد ، ثم انقله إلى منطقة عمل معقمة لإنشاء ثقافات مرور مبكرة. قم بطني أنسجة الورم إلى قطعتين إلى أربع ملليمترات وقم بترطيرها من ثماني إلى 10 مرات في طبق زراعة الأنسجة المعالج بمساحة 10 سنتيمترات مربعة يحتوي على 10 ملليلتر من وسط النمو. زراعة هذه الأنسجة في وسط نمو DMEM-10 عالي الجلوكوز مع استكمال 10 نانومولار نيوريجولين-1 بيتا واثنين من فورسكولين ميكرومولار.
زرع الخلايا السرطانية التي تم تمريرها مبكرا بكثافة 1.5 مرة 10 إلى الخلايا السادسة لكل طبق واحد من 10 سنتيمترات مربعة من زراعة الأنسجة المعالجة يحتوي على وسط نمو DMEM-10. بعد 12 إلى 16 ساعة ، اغسل الثقافات الملتصقة باثنين إلى أربعة ملليلتر من DPBS ، وأصاب الخلايا بالفيروس الغدي بحوالي 400 وحدة لتشكيل اللويحات لكل خلية في 10 ملليلتر من DMEM الخالي من المصل. بعد 48 ساعة من العدوى ، تحقق لفترة وجيزة من الخلايا بحثا عن إشارة EGFP على المجهر الفلوري لضمان العدوى الفعالة بحوالي 50 إلى 100٪ من الخلايا الإيجابية ، ثم يقوم FACS بفرز الخلايا المصابة الإيجابية EGFP.
بعد فرز FACS ، دع الخلايا تتعافى في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 24 إلى 48 ساعة على الأقل ، ثم قم بإعداد الخلايا للتحليلات القائمة على الخلايا في المختبر أو في التطعيم في الجسم الحي. تأكد من حذف Erbb4 عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الحمض النووي الجينومي المعزول من جزء من الخلايا الإيجابية EGFP المفروزة. قم بإجراء اختبارات الانتشار على مدى الأيام السبعة التالية على الخلايا السرطانية المفروزة المطلية في صفيحة من 96 بئرا باستخدام مقياس خلوي آلي قائم على الصور.
قم بتلطيخ الخلايا بالخطافات وأصباغ يوديد البروبيديوم والتقاط صور للخلايا باستخدام قارئ لوحة آلي لحساب عدد الخلايا الحية والميتة في كل بئر. عزل الحمض النووي الريبي الكلي من الخلايا السرطانية المفروزة باستخدام حمض الفينول القياسي جوانيدينيوم والطريقة القائمة على الكلوروفورم. افتح البرنامج لإجراء محاذاة تسلسل الحمض النووي الريبي باتباع الخطوات الخاصة بالبرنامج باستخدام الإعدادات الافتراضية.
حدد طريقة التحليل، وابحث عن الحمض النووي الريبي، ثم حدد الجينوم المرجعي للماوس. قم بتحميل ملف BED إذا تم توفيره بواسطة نواة التسلسل. قم بتحميل ملفات تسلسل FASTQ وقم بتعيين أسماء نسخ متماثلة فريدة للملفات.
تجميع النسخ المتماثل لملفات FASTQ وتعيين الملفات إلى مجموعة نسخ متماثل. للتحليل الإحصائي والتطبيع لتحديد إشارات التعبير الجيني التفاضلي ذات القوة الإحصائية القوية ، افتح برنامج التحليل وحدد ملفات GFP FASTQ كمجموعة بيانات التحكم. بعد ذلك ، حدد DESeq2 كطريقة إحصائية وتطبيع وابدأ التجميع والتحليل.
استخدم مجموعات بيانات أنطولوجيا الجينات المدمجة في أدوات تحليل التخصيب الوظيفي المفتوح الوصول لإجراء تحليل التخصيب الوظيفي على DEG المحدد بوساطة Erbb4 ذات الأهمية الإحصائية لتحديد الأهمية البيولوجية والمسار لفقدان جين Erbb4. حقن الخلايا السرطانية في العصب الوركي للفأر المخدر لتقييم إمكانات نمو الألوغراف في الجسم الحي في الخلايا ما بعد المصابة. بمجرد أن يصل الورم إلى الحجم المطلوب ، قم بتشريح الورم من فأر القتل الرحيم في قسمين إلى ثلاثة أقسام كما هو موضح سابقا.
إصلاح قسم واحد من الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها، ومن ثم تضمين القسم الثابت في البارافين. بعد عمل مقاطع بسماكة خمسة ميكرومترات من أنسجة FFPE ، قم بتركيب القسم على الشرائح وتأكد من وجود خلايا سرطانية في الأنسجة المطعمة باستخدام H & E والتلطيخ المناعي كما هو موضح سابقا. لتأكيد الاختلافات في التعبير في الجسم الحي Erbb4 بين الحالتين التجريبيتين ، قم بتلطيخ الأنسجة الثابتة بالفورمالين والمدمجة في البارافين بأجسام مضادة خاصة ب Erbb4.
تم تحليل نقل خلايا الأنسجة السرطانية الخبيثة للغمد العصبي المحيطي مع الفيروس الغدي. تم الكشف عن الخلايا المعبرة عن EGFP باستخدام المجهر الفلوري ، وتم تحديد العدد الإجمالي للخلايا باستخدام المجهر المتباين الطوري. بعد الاستئصال الجيني بوساطة Cre ، اعتمادا على كفاءة النقل ، أظهر النمط الجيني PCR ضربة قاضية جينية كاملة ومجموعة غير متجانسة من الخلايا المستحثة وغير المستحثة مقارنة بنقل التحكم.
أظهرت الباثولوجيا النسيجية المميزة الموجودة في اللوغاريتبات العظمية لأنسجة ورم غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة مقارنة بالأورام المشتقة من النماذج الحيوانية الأصلية المهندسة وراثيا اختلافا في مورفولوجيا الخلية. أدى استئصال Erbb4 إلى تقليل الكثافة الخلوية والانتشار الخلوي في الخلايا المحولة إلى adeno5-CMV-Cre-ablated التي تتحكم في الخلايا المحولة إلى adeno5-CMV-GFP. تم تقليل التعبير عن Erbb4 في الخلايا السرطانية المنقولة مع adeno5-CMV-Cre ، أو فيروس EGFP ، في النتيجة في allografts adeno5-CMV-Cre المحولة مقارنة بأورام allograft المعالجة ب adeno5-CMV-EGFP.
تم تقييم كثافة الأوعية الدموية عن طريق الكشف عن التفاعل المناعي ل CD31 ، وأظهرت النتائج التمثيلية انخفاضا ملحوظا في كثافة الأوعية الدموية في مجموعات من الخلايا المحولة إلى adeno5-CMV-Cre مقارنة بالخلايا المحولة إلى adeno5-CMV-EGFP. بعد الاستئصال الجيني ، يمكن استخدام الخلايا للعديد من الأنواع المختلفة من الفحوصات القائمة على الخلايا مثل الانتشار أو الهجرة أو نمو 3D أو تغيرات البيئة الدقيقة ، وكذلك للحقن التقويمي في الجسم الحي.
