このプロトコルは、胚致死遺伝子ノックアウトの腫瘍増殖の役割を研究するための代替のin vivo法を提供する。この方法の利点は、通常胚致死的である遺伝子ノックアウトを、遺伝子操作されたマウスモデルに由来する腫瘍において実行して、インビボでの機能効果の喪失を研究することができることである。この技術は、従来の遺伝子ノックアウトマウスモデルでは達成できない胚性必須遺伝子のin vivo役割を研究する必要がある疾患に適用することができる。
動物モデルの生成には時間がかかり、適切な組換えが達成されることを保証するために、アデノウイルス感染に最適なMOIを決定するために実証試験が必要である。まず、所望の遺伝子型を有するマウスを特定する。担がんマウスが人道的なエンドポイントに到達したら、マウスを安楽死させ、滅菌メスナイフを使用して腫瘍を除去します。
メスナイフを使用してパンローフスタイルの切り口で腫瘍を3つの切片に解剖し、ホルマリン固定パラフィン埋め込み早期継代培養生成および分析分析のためのフラッシュ凍結のための組織セグメントを生成する。厚さ5マイクロメートルのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片をヘマトキシリンとエオジンで染色します。病理学者が腫瘍を確認したら、免疫組織化学染色を行い、腫瘍診断を確認する。
採取したばかりの悪性末梢神経鞘腫瘍組織を氷上の氷冷滅菌PBS10ミリリットルに入れ、滅菌作業領域に移し、早期継代培養を確立した。腫瘍組織を2〜4ミリメートル片に細かく刻み、10ミリリットルの増殖培地を含む10平方センチメートルの処理組織培養皿中で8〜10回トリチュレートする。これらの組織を、10ナノモルのノイレグリン−1βおよび2マイクロモルのフォルスコリンを添加した高グルコースDMEM−10増殖培地中で培養する。
DMEM-10増殖培地を含む処理組織培養皿に6個目の細胞1個あたり10~10.5倍の密度で初期継代した腫瘍細胞を播種する。12〜16時間後、付着培養物を2〜4ミリリットルのDPBSで洗浄し、10ミリリットルの無血清DMEM中の細胞あたり約400プラーク形成単位でアデノウイルスを細胞に感染させる。感染から48時間後、蛍光顕微鏡で細胞のEGFPシグナルを簡単にチェックし、約50~100%陽性細胞への効率的な感染を確認し、FACSはEGFP陽性感染細胞を選別します。
FACSソーティング後、細胞を組織培養インキュベーター内で少なくとも24〜48時間回収させ、次いで、in vitro細胞ベースの分析またはin vivo移植のために細胞を調製する。選別されたEGFP陽性細胞の一部から単離したゲノムDNAを用いてPCRを行うことにより、Erbb4欠失を確認する。画像ベースの自動サイトメーターを使用して、96ウェルプレートに播種した選別腫瘍細胞について、次の7日間にわたって増殖アッセイを行います。
フックとヨウ化プロピジウム色素で細胞を染色し、自動プレートリーダーを使用して細胞の画像をキャプチャし、各ウェルの生細胞と死細胞の数をカウントします。標準的な酸性グアニジニウムフェノールおよびクロロホルムベースの方法を用いて、選別された腫瘍細胞から総RNAを単離する。ソフトウェアを開き、デフォルト設定を使用してプログラム固有の手順に従ってRNA配列アラインメントを実行します。
解析方法を選択し、RNAシークを行い、マウス参照ゲノムを選択します。BED ファイルがシーケンス コアによって提供されている場合は、BED ファイルをアップロードします。FASTQ シーケンス ファイルをアップロードし、ファイルに一意のレプリケート名を割り当てます。
グループは FASTQ ファイルをレプリケートし、ファイルをレプリケート セットに指定します。統計解析および正規化解析で、堅牢な統計的検出力を持つ差次遺伝子発現シグナルを同定するには、解析ソフトウェアを開き、GFP FASTQファイルをコントロールデータセットとして選択します。次に、統計および正規化の方法として DESeq2 を選択し、アセンブリと分析を開始します。
オープンアクセス機能エンリッチメント解析ツールに統合された遺伝子オントロジーデータセットを使用して、同定された統計的に有意なErbb4媒介性DEGに対して機能エンリッチメント解析を実行し、Erbb4遺伝子損失の生物学的および経路的有意性を決定する。腫瘍細胞を麻酔したマウスの坐骨神経に注入し、感染後細胞におけるin vivo同種移植片増殖能を評価した。腫瘍が必要なサイズに達したら、前述のように、安楽死マウスから腫瘍を2〜3つのセクションに解剖します。
1つの組織切片を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定し、固定した切片をパラフィンに埋め込む。FFPE組織から厚さ5マイクロメートルの切片を作製した後、スライドに切片をマウントし、前述のようにH&Eおよび免疫染色を用いて移植組織中の腫瘍細胞の存在を確認する。2つの実験条件間のインビボErbb4発現の違いを確認するために、ホルマリン固定パラフィン包埋組織をErbb4特異的抗体で染色する。
アデノウイルスによる悪性末梢神経鞘腫瘍組織細胞の形質導入を解析した。蛍光顕微鏡を用いてEGFP発現細胞を検出し、位相差顕微鏡を用いて全細胞数を測定した。Cre媒介遺伝子アブレーションの後、トランスフェクション効率に応じて、PCRジェノタイピングは、対照形質導入と比較して、完全な遺伝子ノックアウトおよび誘導および非誘導細胞の不均一な集団を示した。
悪性末梢神経鞘腫瘍組織の同所性同種移植片に見られる特徴的な組織病理学は、元の遺伝子操作動物モデルに由来する腫瘍と比較して、細胞形態の違いを実証した。Erbb4アブレーションは、アデノ5-CMV-Creアブレーション細胞がアデノ5-CMV-GFP形質導入細胞を制御する際の細胞密度および細胞増殖を低下させた。adeno5-CMV-Cre、またはEGFPウイルスで形質導入された腫瘍細胞におけるErbb4の発現は、その結果、対照のadeno5-CMV-EGFP処理同種移植片腫瘍と比較して、adeno5-CMV-Cre形質導入同種移植片において減少した。
血管密度をCD31の免疫反応性検出を介して評価し、代表的な結果は、対照のadeno5-CMV-EGFP形質導入細胞と比較して、adeno5-CMV-Cre形質導入細胞の同種移植片において血管密度が著しく低下したことを示した。遺伝子アブレーション後、細胞は、増殖、遊走、3D増殖、または微小環境の変化などの多くの異なるタイプの細胞ベースのアッセイ、ならびにin vivo同所性注射に使用することができる。
