Dieses Protokoll bietet eine alternative In-vivo-Methode, um die Tumorwachstumsrolle eines embryonalen tödlichen Gen-Knockouts zu untersuchen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass Gen-Knockouts, die normalerweise embryonal tödlich sind, in Tumoren durchgeführt werden können, die aus einem gentechnisch veränderten Mausmodell stammen, um ihre Funktionsverlusteffekte in vivo zu untersuchen. Diese Technik kann auf Krankheiten angewendet werden, die eine Untersuchung der In-vivo-Rolle embryonaler essentieller Gene erfordern, die von herkömmlichen Gen-Knockout-Mausmodellen nicht erreichbar sind.
Die Erstellung des Tiermodells erfordert Zeit, und empirische Tests sind erforderlich, um den optimalen MOI für eine adenovirale Infektion zu bestimmen, um sicherzustellen, dass eine geeignete Rekombination erreicht wird. Identifizieren Sie zunächst die Maus mit dem gewünschten Genotyp. Wenn eine tumortragende Maus ihren humanen Endpunkt erreicht, euthanasieren Sie die Maus und verwenden Sie ein steriles Skalpellmesser, um den Tumor zu entfernen.
Sezieren Sie den Tumor in drei Abschnitte in Brotlaib-Schnitten mit einem Skalpellmesser, um die Gewebesegmente für die Formalinfixierung Paraffin zu erzeugen, die frühe Passagekulturerzeugung und das Einfrieren von Flash für analytische Analysen einbettet. Färben Sie einen fünf Mikrometer dicken formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeabschnitt mit Hämatoxylin und Eosin. Sobald ein Pathologe den Tumor bestätigt, führen Sie die immunhistochemische Färbung durch, um die Tumordiagnose zu bestätigen.
Legen Sie das frisch gesammelte maligne periphere Nervenscheidentumorgewebe in 10 Milliliter eiskaltes steriles PBS auf Eis und übertragen Sie es dann in einen sterilen Arbeitsbereich, um frühe Passagekulturen zu etablieren. Zerkleinern Sie das Tumorgewebe in zwei bis vier Millimeter große Stücke und ritutieren Sie es acht- bis 10-mal in einer 10 Quadratzentimeter großen behandelten Gewebekulturschale mit 10 Millilitern Wachstumsmedium. Kultivieren Sie diese Gewebe in einem DMEM-10-Wachstumsmedium mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 nanomolaren Neuregulin-1-beta und zwei mikromolaren Forskolin.
Samen Sie die früh durchgangenen Tumorzellen in einer Dichte von 1,5 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro einer 10 Quadratzentimeter behandelten Gewebekulturschale, die DMEM-10-Wachstumsmedium enthält. Nach 12 bis 16 Stunden waschen Sie die adhärenten Kulturen mit zwei bis vier Millilitern DPBS und infizieren Sie die Zellen mit Adenovirus bei etwa 400 plaquebildenden Einheiten pro Zelle in 10 Millilitern serumfreiem DMEM. Überprüfen Sie nach 48 Stunden der Infektion kurz die Zellen auf EGFP-Signal auf einem Fluoreszenzmikroskop, um eine effiziente Infektion mit etwa 50 bis 100% positiven Zellen sicherzustellen, und sortieren Sie dann die EGFP-positiven infizierten Zellen durch FACS.
Lassen Sie die Zellen nach der FACS-Sortierung mindestens 24 bis 48 Stunden in einem Gewebekultur-Inkubator erholen und bereiten Sie die Zellen dann für In-vitro-Zellanalysen oder In-vivo-Transplantationen vor. Bestätigen Sie die Erbb4-Deletion, indem Sie eine PCR mit genomischer DNA durchführen, die aus einem Teil der sortierten EGFP-positiven Zellen isoliert wurde. Führen Sie die Proliferationsassays in den nächsten sieben Tagen an sortierten Tumorzellen durch, die in einer 96-Well-Platte mit einem bildbasierten automatisierten Zytometer plattiert sind.
Färben Sie die Zellen mit Haken und Propidiumiodidfarbstoffen und erfassen Sie die Bilder der Zellen mit einem automatisierten Plattenleser, um die Anzahl der lebenden und toten Zellen in jedem Bohrloch zu zählen. Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus sortierten Tumorzellen mit Standard-Säure-Guanidinium-Phenol und Chloroform-basierter Methode. Öffnen Sie die Software, um die RNA-Sequenzausrichtung nach den programmspezifischen Schritten mit den Standardeinstellungen durchzuführen.
Wählen Sie die Analysemethode, RNA seek, und wählen Sie dann das Mausreferenzgenom aus. Laden Sie die BED-Datei hoch, wenn sie vom Sequenzierungskern bereitgestellt wird. Laden Sie die FASTQ-Sequenzierungsdateien hoch und weisen Sie den Dateien eindeutige Replikatnamen zu.
Gruppe replizieren die FASTQ-Dateien und legen die Dateien einem Replikatsatz fest. Für die statistische und Normalisierungsanalyse zur Identifizierung der differentiellen Genexpressionssignale mit robuster statistischer Aussagekraft öffnen Sie die Analysesoftware und wählen Sie die GFP FASTQ-Dateien als Steuerdatensatz aus. Wählen Sie als Nächstes DESeq2 als statistische und Normalisierungsmethode aus, und starten Sie die Baugruppe und Analyse.
Verwenden Sie die Genontologie-Datensätze, die in die Open-Access-Tools zur funktionellen Anreicherungsanalyse integriert sind, um die funktionelle Anreicherungsanalyse an der identifizierten statistisch signifikanten Erbb4-vermittelten DEG durchzuführen, um die biologische und Signalwegsbedeutung des Erbb4-Genverlusts zu bestimmen. Injizieren Sie die Tumorzellen in den Ischiasnerv der betäubten Maus, um das Wachstumspotenzial des In-vivo-Allotransplantats in postinfizierten Zellen zu beurteilen. Sobald der Tumor die erforderliche Größe erreicht hat, sezieren Sie den Tumor von einer eingeschläferten Maus in zwei bis drei Abschnitten, wie zuvor gezeigt.
Fixieren Sie einen Gewebeabschnitt in 4% Paraformaldehyd über Nacht und betten Sie dann den festen Abschnitt in das Paraffin ein. Nachdem Sie fünf Mikrometer dicke Abschnitte aus dem FFPE-Gewebe hergestellt haben, montieren Sie den Abschnitt auf den Objektträgern und bestätigen Sie das Vorhandensein von Tumorzellen im transplantierten Gewebe mit H & E und Immunfärbung, wie zuvor gezeigt. Um die in vivo Erbb4-Expressionsunterschiede zwischen den beiden experimentellen Bedingungen zu bestätigen, färben Sie das formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe mit Erbb4-spezifischen Antikörpern.
Die Transduktion der malignen peripheren Nervenscheidentumorgewebezellen mit Adenovirus wurde analysiert. Die EGFP-exprimierenden Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen und die Gesamtzahl der Zellen mittels Phasenkontrastmikroskopie bestimmt. Nach der Cre-vermittelten Genablation zeigte die PCR-Genotypisierung je nach Transfektionseffizienz einen vollständigen Gen-Knockout und eine heterogene Population von induzierten und uninduzierten Zellen im Vergleich zur Kontrolltransduktion.
Die charakteristische Histopathologie, die in den orthotopen Allotransplantaten von malignen peripheren Nervenscheidentumorgeweben im Vergleich zu den Tumoren gefunden wurde, die von den ursprünglichen gentechnisch veränderten Tiermodellen abgeleitet wurden, zeigte einen Unterschied in der Zellmorphologie. Die Erbb4-Ablation verringerte die Zelldichte und die Zellproliferation in adeno5-CMV-Cre-ablatierten Zellen kontrollieren adeno5-CMV-GFP-transduzierte Zellen. Die Expression von Erbb4 in den Tumorzellen, die mit Adeno5-CMV-Cre oder EGFP-Virus transduziert wurden, war im Ergebnis in adeno5-CMV-Cre-transduzierten Allotransplantaten im Vergleich zu den mit Adeno5-CMV-EGFP behandelten Allotransplantattumoren verringert.
Die vaskuläre Dichte wurde durch Immunreaktivitätsnachweis für CD31 bewertet, und die repräsentativen Ergebnisse zeigten eine deutlich reduzierte vaskuläre Dichte in Allotransplantaten von adeno5-CMV-Cre-transduzierten Zellen im Vergleich zu den Kontroll-Adeno5-CMV-EGFP-transduzierten Zellen. Nach der Genablation können die Zellen für viele verschiedene Arten von zellbasierten Assays wie Proliferation, Migration, 3D-Wachstum oder Veränderungen der Mikroumgebung sowie für orthotope In-vivo-Injektionen verwendet werden.
