يرشد هذا البروتوكول الشامل كيفية توليد جينوم وثيق من البكتيريا البولية المتنوعة ويمكن القراء الذين ليس لهم خبرة في الترميز من تنفيذ أنابيب تجميع وتحليل الجينوم المستندة إلى المحطة الطرفية بنجاح. تمكن تجميعات الجينوم الكاملة من اكتشاف الجينات التي تساهم في الاستعمار والفوعة بين البكتيريا المرضية والمسالك البولية. توفر الجينومات القريبة نظرة ثاقبة على بنية الجينوم والعناصر الوراثية المتنقلة.
يمكن تطبيق طريقة تجميع الجينوم الهجين على أي بكتيريا قابلة للتكريس معزولة عن المواقع التشريحية الأخرى أو المنافذ البيئية لتوفير رؤى مماثلة في محتوى الجينوم والهندسة المعمارية. اتبع البروتوكول ودليل الشركة المصنعة لإعداد تجمع الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل والمضي قدما لتنظيف بإضافة 2.5 أضعاف حجم الخرز المغنطيسي إلى تجمع الحمض النووي، ومن ثم النقر بلطف أنبوب لخلط المحتويات. تدور لفترة وجيزة أسفل العينة في 2000 مرة G ووضع العينة على الدوار لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم بيليه الخرز على المغناطيس.
بعد ذلك ، اغسل بيليه مرتين مع 250 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 70٪ في الماء الخالي من النيوكليز دون إزعاج بيليه. اترك الأنبوب على المغناطيس أثناء الغسل. أسبيرات الإيثانول بعد كل غسل، ثم تدور لفترة وجيزة أسفل العينة في 2، 000 مرة G قبل إعادته إلى المغناطيس.
ماصة قبالة الإيثانول المتبقية والسماح للبيليه لتجف لمدة 30 ثانية. مرة واحدة المجففة، وإعادة إنفاق بيليه في 60 إلى 70 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز واحتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين، ثم بيليه العينة على المغناطيس حتى elute واضحة. نقل elute إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف 1.5 ملليلتر.
قياس تجمع الحمض النووي المتقطعة المزدوجة المركزة باستخدام مقياس الفلور، ثم إعداد aliquot من 700 نانوغرام من العينة في 65 ميكرولتر الحجم النهائي للمضي قدما إلى خطوة ربط محول والاحتفاظ بما تبقى من حمام السباحة في أربع درجات مئوية لتشغيل الثانية بعد الانتهاء من التشغيل الأول. استمر في ربط المحول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. للمتابعة مع التسلسل، اخلط المخازن المؤقتة الأولية ورئيس الخلية تدفق.
قم بإعداد حل مكتبة DNA ثم قم بتحميل العينة المنسدلة على منفذ التحميل. بدء تشغيل التسلسل. افتح برنامج التشغيل للتسلسل وانقر على زر البدء، ثم أدخل اسما للتجربة.
انتقل إلى متابعة اختيار عدة لتحديد مجموعة الإعدادية مكتبة المناسبة وحزمة توسيع الباركود المستخدمة ومن ثم انقر على مواصلة تشغيل الخيارات. إذا التخطيط لإعداد مكتبة كافية لتشغيل ثانية، ضبط طول التشغيل من 72 ساعة الافتراضية إلى 48 ساعة ثم اضغط متابعة basecalling. تحقق من خيار basecalling في تكوين basecalling السريع.
تعيين ترميز لتمكين بحيث سيتم اقتطاع الإخراج FASTQ قبالة تسلسل الباركود وإزالة multixed في دلائل منفصلة استنادا إلى الباركود. انقر على مواصلة الانتاج. بعد ذلك، اختر مكان حفظ بيانات تسلسل الإخراج.
توقع ما يقرب من 30 إلى 50 غيغابايت من البيانات إذا حفظ إخراج FASTQ فقط وأكثر من 500 غيغابايت من البيانات إذا حفظ إخراج FAST5. إذا كان التخطيط للمتابعة في التصفية اليدوية بعد التسلسل، قم بإلغاء تحديد خيار التصفية Qscore seven في طول القراءة غير المصفاة. وإلا، اترك الخيار المحدد.
انتقل إلى متابعة تشغيل علامة التبويب الإعداد لمراجعة كافة الإعدادات. إذا كانت الإعدادات صحيحة، انقر على زر البدء. آخر، انقر على العودة لإجراء أي تعديلات ضرورية.
في دليل القراءات الطويلة، قم بإنشاء دلائل جديدة لكل رمز شريطي يستخدم في التشغيل. نسخ كافة الملفات fastq التي تتوافق مع كل الباركود في المجلد المناسب. الجمع بين جميع الملفات fastq لكل الباركود من كل شوط.
بمجرد دمج الملفات، افتح المحطة الطرفية وانتقل إلى دلائل الباركود ضمن دليل القراءات الطويلة باستخدام الأمر cd. لسلسلة كافة ملفات fastq لكل الباركود في ملف fastq واحد، تنفيذ الأمر وتكرار الإجراء لكل الباركود. استخدم NanoStat لتقييم جودة قراءة العينة بتنفيذ الأمر ثم قم بتسجيل النتائج عن طريق نسخ الإخراج إلى نص أو ملف Word للرجوع إليه في المستقبل.
بعد حفظ النتائج، استخدم NanoFilt لتصفية قراءات MinION، وتجاهل القراءات مع Q أقل من سبعة وطول أقل من 200 بواسطة تنفيذ الأمر. تشغيل NanoStat مع الأمر على الملف الذي تم إنشاؤه قلصت. تسجيل النتائج عن طريق نسخ الإخراج إلى نص أو ملف Word ومقارنة النتائج السابقة للتأكد من نجاح التصفية.
كرر الخطوات لكل الباركود المستخدمة في تشغيل التسلسل. لإنشاء تجميع الجينوم المختلط، قم بتنظيم ملفات القراءة القصيرة وملفات القراءة الطويلة في دليل واحد يسمى trimmed_reads. لذلك يحتوي الدليل على fastq تم إنشاؤه مسبقا.
gz ملف لقراءات طويلة قلصت وs fastq اثنين. gz الملفات كما R1 و R2 لقراءات قصيرة قلصت. انتقل إلى الدليل trimmed_reads الذي يخزن الملفات المقروءة باستخدام الأمر cd في المحطة الطرفية.
مرة واحدة في الدليل الصحيح ، الرمز البريدي اثنين من الملفات قراءة قصيرة لتخزين في fastq. gz تنسيق بتنفيذ الأمر. كرر الخطوة لكل من R1 و R2. تأكد من أن جميع الملفات المقروءة في fastq.
gz تنسيق والتحقق من أن جميع الملفات تطابق نفس عزل. بدء التجميع المختلط باستخدام Unicycler عن طريق تشغيل الأمر. عند اكتمال التشغيل، راجع أحادي الدراجة.
سجل الملف لضمان عدم وجود أخطاء. تسجيل عدد وحجم وحالة كاملة أو غير كاملة للسياق الذي تم إنشاؤه. إذا تم تعريف سياقات غير كاملة في سجل Unicycler، أعد تشغيل Unicycler في وضع غامق بإضافة العلامة إلى الأمر.
فتح ضمادة وانقر على الملف، ثم اختر تحميل الرسم البياني وحدد التجمع. gfa الملف الذي تم حفظه مسبقا إلى unicycler_output_directory التي تم إنشاؤها بواسطة Unicycler. بمجرد تحميل الملف، انقر فوق الزر رسم الرسم البياني على شريط الأدوات الأيسر وتقييم ما إذا كان التجميع مكتملا من خلال فحص كيفية توصيل الكواغ وتنظيمها.
انتقل داخل المحطة الطرفية إلى المجلد الذي يخزن الإخراج Unicycler باستخدام الأمر cd. ثم تشغيل بروتوكول quast بتنفيذ الأمر. راجع التقارير التي تم إنشاؤها بواسطة quast في دليل الإخراج quast_output_directory.
انتقل داخل المحطة الطرفية إلى المجلد الذي يخزن الإخراج Unicycler باستخدام الأمر cd، ثم قم بتشغيل prokka بتنفيذ الأمر. راجع التعليقات التوضيحية عن طريق فتح جدول tsv وتحميل ملف gff الذي تم إنشاؤه في برنامج تحليل التسلسل. تصور وتحليل التعليقات التوضيحية في البرنامج.
في الصور هلام ممثل، يتم تصوير الحمض النووي الجينومي أو نتائج استخراج gDNA. ويمكن ملاحظة نجاح استخراج وفصل gDNA سليمة. كما يصور استخراج غير ناجحة تظهر تلوث gDNA مجزأة والجيش الملكي النيبالي.
تم إنشاء الرسوم البيانية لتجميع الجينوم من البكتيريا من قبل يونيسيكلر الهجين دي نوفو التجمع وتصور من قبل ضمادة. أظهر الجينوم الكامل لكليبسيلا أوكسيتوكا كوبف10 كروموسوما مغلقا واحدا ويتكون الجينوم الكامل لكليبسيلا الالتهاب الرئوي KpPF25 من كروموسوم مغلق وخمسة بلازميدات مغلقة. الكروموسوم غير مكتملة من Klebsiella الالتهاب الرئوي KpPF46 تتكون من اثنين من المتجاورة مترابطة.
خرائط التجميع التي تم إنشاؤها بواسطة Geneious Prime للجينوم الكامل لكليبسيلا أوكسيتوكا KoPF10 وKlebsiella pneumoniae KpPF25 تظهر الجينات المشروحة التي تشير إليها السهام الملونة على طول العمود الفقري البلازميد. لضمان نجاح تحميل الخلية التدفق، تصفية قراءات طويلة باستخدام الإعدادات الموصى بها والتأكد من أن جميع الملفات في fastq. gz الشكل.
تشغيل الأمر Unicycler الصحيح باستخدام الملفات التي تنتمي إلى نفس العينة.
