Bu kapsamlı protokol, çeşitli üriner bakterilerin yakın genomlarının nasıl üretilmelerini sağlar ve kodlama deneyimi olmayan okuyucuların terminal tabanlı genom montaj ve analiz boru hatlarını başarıyla uygulamasına olanak tanır. Komple genom derlemeleri, kommensal ve üropatik bakteriler arasında kolonizasyona ve virülansa katkıda bulunan genlerin keşfedilmesini sağlar. Yakın genomlar, genom mimarisi ve mobil genetik elementler hakkında fikir sağlar.
Hibrit genom montaj yöntemi, genom içeriği ve mimarisi hakkında benzer içgörüler sağlamak için diğer anatomik bölgelerden veya çevresel nişlerden izole edilmiş herhangi bir kült bakteriye uygulanabilir. Çift iplikli bir DNA havuzu hazırlamak için protokol ve üretici kılavuzunu izleyin ve DNA havuzuna 2,5 kat daha fazla paramanyetik boncuk ekleyerek ve ardından içeriği karıştırmak için tüpü hafifçe sallayarak temizlemeye devam edin. Numuneyi kısaca 2.000 kez G'de döndürün ve numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir rotatora yerleştirin, ardından boncukları mıknatısa saçma.
Daha sonra, peletı bozmadan nükleaz içermeyen suda 250 mikrolitre taze hazırlanmış% 70 etanol ile iki kez yıkayın. Yıkama sırasında tüpü mıknatısın üzerinde bırakın. Her yıkamadan sonra etanol epirat, sonra mıknatısa geri vermeden önce numuneyi 2.000 kez G'de kısa bir süre döndürün.
Pipet artık etanol kapalı ve pelet 30 saniye kurumaya bırakın. Kuruduktan sonra, peletı 60 ila 70 mikrolitre çekirdeksiz suda yeniden depolayın ve numuneyi oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya bırakın, ardından numuneyi elute temizleninceye kadar mıknatıs üzerinde peletleyin. Elute'yi temiz bir 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Konsantre çift iplikli DNA havuzunu bir florometre kullanarak ölçün, ardından adaptör ligasyon adımına devam etmek ve ilk çalıştırma bittikten sonra havuzun geri kalanını ikinci bir çalışma için dört santigrat derecede tutmak için 65 mikroliter son hacimde numunenin 700 nanogramlık bir aliquotunu hazırlayın. Üretici talimatlarına göre adaptör ligasyonuna devam edin. Sıralamaya devam etmek için astar tamponlarını karıştırın ve akış hücresini astarlayın.
DNA kitaplığı çözümünü hazırlayın ve numuneyi damla yönünde yükleme bağlantı noktasına yükleyin. Sıralama çalıştırmasını başlatın. Sıralama için işletim yazılımını açın ve başlat düğmesine tıklayın, ardından deneme için bir ad girin.
Kullanılan uygun kitaplık hazırlık kitini ve barkod genişletme paketini seçmek için kit seçimine devam edin ve ardından Çalıştırmaya devam et seçeneklerine tıklayın. İkinci bir çalışma için yeterli bir kitaplık hazırlamayı planlıyorsanız, çalışma uzunluğunu varsayılan 72 saatten 48 saate ayarlayın ve basecalling'e devam edin. Config fast basecalling'de basecalling seçeneğini işaretleyin.
Çıkış FASTQ'sunda barkod dizilerinden kırpılacak ve barkoda dayalı ayrı dizinler halinde çoklamadan devre dışı bırakılacak şekilde barkodlamayı etkin olarak ayarlayın. Çıktı almaya devam et'e tıklayın. Ardından, çıktı sıralama verilerinin kaydedileceği yeri seçin.
Yalnızca FASTQ çıktısını kaydediyorsa yaklaşık 30 ila 50 gigabayt veri ve FAST5 çıkışını kaydediyorsanız 500 gigabayttan fazla veri bekleyin. Sıralamadan sonra el ile filtrelemeye devam etmeyi planlıyorsanız, okuma uzunluğundaki Qscore seven filtreleme seçeneğinin işaretini filtresiz olarak kaldırın. Aksi takdirde, seçeneği işaretli bırakın.
Tüm ayarları gözden geçirmek için Kurulum sekmesini çalıştırmaya devam edin. Ayarlar doğruysa, başlat düğmesine tıklayın. Aksi takdirde, gerekli ayarlamaları yapmak için geri tıklayın.
Uzun okuma dizininde, çalıştırmada kullanılan her barkod için yeni dizinler oluşturun. Her barkoda karşılık gelen tüm fastq dosyalarını uygun klasöre kopyalayın. Her çalıştırmadan her barkod için tüm fastq dosyalarını birleştirin.
Dosyalar birleştirildikten sonra, terminali açın ve cd komutunu kullanarak uzun okuma dizini içindeki barkod dizinlerine gidin. Barkod başına tüm fastq dosyalarını tek bir fastq dosyasında bire bir yapmak için komutu çalıştırın ve her barkod için yordamı yineleyin. Komutu yürüterek örneğin okuma kalitesini değerlendirmek için NanoStat'ı kullanın ve sonra çıktıyı ileride başvurmak üzere bir metne veya Word dosyasına kopyalayarak sonuçları kaydedin.
Sonuçlar kaydedildikten sonra, Komutu çalıştırarak Q yediden küçük ve uzunluğu 200'den az olan okumaları atarak MinION okumalarını filtrelemek için NanoFilt'i kullanın. Oluşturulan kırpılmış dosyada, NanoStat komutunu çalıştırın. Çıktıyı bir metne veya Word dosyasına kopyalayarak sonuçları kaydedin ve filtrelemenin başarılı olduğundan emin olmak için önceki sonuçlarla karşılaştırın.
Sıralama çalıştırmasında kullanılan her barkod için adımları yineleyin. Karma genom derlemesi oluşturmak için, kısa okuma dosyalarını ve uzun okuma dosyalarını trimmed_reads adlı tek bir dizinde düzenleyin. Yani dizin daha önce oluşturulmuş bir fastq içeriyor.
kesilmiş uzun okumalar ve iki fastq için gz dosyası. gz dosyaları olarak R1 ve R2 kesilmiş kısa okumalar için. Terminaldeki cd komutunu kullanarak okuma dosyalarını depolayan dizin trimmed_reads gidin.
Doğru dizine girdikten sonra, fastq'ta saklamak için iki kısa okuma dosyasını fermuarlayın. komutu yürüterek gz biçimini. Hem R1 hem de R2 için adımı yineleyin. Tüm okuma dosyalarının fastq'ta olduğundan emin olun.
gz biçimini kullanın ve tüm dosyaların aynı yalıtıcıyla eşleştiğini doğrulayın. Komutu çalıştırarak Unicycler kullanarak karma derlemeye başlayın. Çalıştırma tamamlandığında, tek tekerlekli bisikleti gözden geçirin.
hata olmadığından emin olmak için günlük dosyasına bakın. Oluşturulan bağlamın sayısını, boyutunu ve tam veya eksik durumunu kaydedin. Unicycler günlüğünde tamamlanmamış bağlamlar tanımlanmışsa, bayrağı komuta ekleyerek Unicycler'ı kalın modda yeniden çalıştırın.
Bandaj'ı açın ve dosyaya tıklayın, ardından yükleme grafiğini seçin ve montajı seçin. daha önce Unicycler tarafından oluşturulan unicycler_output_directory kaydedilen gfa dosyası. Dosya yüklendikten sonra, sol araç çubuğundaki grafik çiz düğmesine tıklayın ve contigs'in nasıl bağlanıp düzenlendiğini inceleyerek montajın tamamlanıp tamamlan olmadığını değerlendirin.
Terminal içinde CD komutunu kullanarak Unicycler çıktısını depolayan klasöre gidin. Ardından komutu yürüterek quast protokolünü çalıştırın. Quast_output_directory çıktı dizininde quast tarafından oluşturulan raporları gözden geçirin.
Terminal içinde cd komutunu kullanarak Unicycler çıktısını depolayan klasöre gidin, sonra komutu yürüterek prokka'yı çalıştırın. Tsv tablosunu açarak ve oluşturulan gff dosyasını sıra analiz yazılımına yükleyerek ek açıklamaları gözden geçirin. Yazılımdaki ek açıklamaları görselleştirin ve analiz edin.
Temsili jel görüntülerinde genomik DNA veya gDNA ekstraksiyon sonuçları tasvir edilir. Başarılı ekstraksiyon ve bozulmamış gDNA'nın ayrılması gözlenebilir. Parçalanmış gDNA ve RNA kontaminasyon gösteren başarısız ekstraksiyon da tasvir edilir.
Bakterilerin genom montaj grafikleri Unicycler hybrid de novo montajı tarafından üretildi ve Bandaj tarafından görselleştirildi. Klebsiella oxytoca KoPF10'un tam genomunda tek bir kapalı kromozom ortaya çıktı ve Klebsiella pneumoniae KpPF25'in tam genomları kapalı bir kromozom ve beş kapalı plazmidden oluşuyordu. Klebsiella pneumoniae KpPF46'nın tamamlanmamış kromozomu birbirine bağlı iki contigsten oluşuyordu.
Geneious Prime tarafından Klebsiella oxytoca KoPF10 ve Klebsiella pneumoniae KpPF25'in tam genomu için oluşturulan montaj haritaları, plazmid omurgalar boyunca renkli oklarla gösterilen açıklamalı genleri gösterir. Akış hücresi yüklemesinin başarılı olduğundan emin olmak için, önerilen ayarları kullanarak uzun okumaları filtreleyin ve tüm dosyaların fastq'ta olduğundan emin olun. gz biçimi.
Aynı örneğe ait dosyaları kullanarak doğru Unicycler komutunu çalıştırın.
